【正文】 物制成懸浮液，用接種環(huán)挑取懸液，在培養(yǎng)基斜面上劃線接種，視需要可穿刺接種底部，置 37℃ 培養(yǎng) 4 天，每天觀察記錄一次。置于適溫下培養(yǎng) 27 天，如為陽性反應(yīng)的須延長培養(yǎng)時(shí)間數(shù)天。檢驗(yàn)時(shí)按培養(yǎng)液的十分之一加入 O’Meara 試劑，充分搖勻。用待測的新鮮斜面菌接種于以上培養(yǎng)液中，再用鑷子夾取一條醋酸鉛紙條放入試管內(nèi)，用棉塞塞住懸于試管中，使試紙下端接近培養(yǎng)液表面，但不接觸培養(yǎng)液，另接種一管已知陰性反應(yīng)菌種和空白無接種管一支．于適當(dāng)溫度下培養(yǎng)。 (9) 葡萄糖 Hugh——Leifson 試驗(yàn) 每支試管裝 5mL 培養(yǎng)基 (蛋白胨 ， NaCl ， K2HPO4 ，葡萄糖 ， 16 瓊脂 ， 1%澳百里酚蘭液 ，蒸餾水 100mL， )，滅菌后直立凝固，穿刺接種細(xì)菌，同時(shí)接兩支，一管不加凡士林，另一管加 厘米厚的熔化的無菌凡士林。7H2O ， NaCl 5g，酵母浸膏 ， 1%澳百里酚蘭液 ，糖 10g． L1， 蒸餾水1000mL， )。 生長特性研究 最適碳源試驗(yàn)：將菌種在含有農(nóng)藥的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24h，制成種子液，按10%的接種量接于含 300mg/L的毒死蜱的無機(jī)鹽培養(yǎng)基的三角瓶中，分別以甲醇、乙醇、丙酮、葡萄糖、蔗 糖、對(duì)硝基苯酚為碳源， 置于 160r/ min ,30 ℃ 搖床培養(yǎng)24h測其 OD600值。 最適溫度試驗(yàn) : 菌種在含有農(nóng)藥的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24h，制成種子液，按10%的接種量接種于含 300mg/L 的毒死蜱、 1g/L 的葡萄糖的無機(jī)鹽培養(yǎng)基的三 17 角瓶中，分別置于室溫 15℃ 、 22℃ 、 30℃ 、 37℃ 、 42℃ 下 160r/ min 搖床培養(yǎng) 24h測其 OD600 值。 細(xì)菌分析結(jié)果 1. 形態(tài)觀察 X01: 革蘭氏陽性菌，短棒狀、排列成串；菌落乳白色、不規(guī)則凸起、表面較干燥、生長良好。 2．生理生化性質(zhì)測定 見表 由此鑒定 3 種菌均為假單胞菌屬 (Pesudomonas)。分生孢子無色 ， 分為大小兩種類型 ： 小型孢 子數(shù)量較少 ,多為單細(xì)胞 ， 也有雙細(xì)胞卵圓形或長圓形 ， 單生 ； 大型孢子數(shù)量多 ,為 4個(gè)細(xì)胞 ， 微彎 ,鐮刀形 ， 無足細(xì)胞和厚垣孢子。大型孢子數(shù)量極少 ， 為 4個(gè)細(xì)胞 ， 微彎 ， 兩端鈍 20 圓 ,鐮刀形 ， 無足細(xì)胞和厚垣孢子。 由圖 3. 1(a)可知，降解菌中的細(xì)菌最適碳源為葡萄糖。試驗(yàn)選取葡萄糖的濃度分別為 、 、 、 、。在 30℃ 、160 r/min條件下培養(yǎng) 24h后于波長 600下測量吸光度。 (a)015 6 7 8 9初始pH值OD600 XO1X02X03 (b)05 6 7 8 9初始pH值OD600Z01Z02 圖 3. 3 最適 pH值曲線 Fig The curve of optimum pH range 23 不同溫度對(duì)菌株生長的影響 溫度是影響微生物生長和生存的最重要的環(huán)境因素之一。C)OD600XO1X02X03 (b)0115 22 30 37 45溫度(176。 (a)0160 120 240 480 960毒死蜱濃度(mg/L)OD600XO1X02X03 (b)0160 120 240 480 960毒死蜱濃度(mg/L)OD600Z01Z02 圖 3. 5 毒死蜱濃度對(duì)菌株生長的影響 Effect of chlorpyrifos concentrations on growth condition 25 第四章 總結(jié)與展望 總結(jié) 利用微生物及其產(chǎn)生的降解酶處理環(huán)境中的有機(jī)磷農(nóng)藥己顯示出良好的應(yīng)用前景，是近年來有機(jī)磷農(nóng)藥降解的主要發(fā)展方向。 (3) 在 5株降解菌株中，真菌的生長條件適應(yīng)范圍比細(xì)菌要廣，因此真菌降解有機(jī)磷農(nóng)藥的應(yīng)用前景更好。 (4)采用基因工程相關(guān)技術(shù)，將 降解菌株 的降解酶的基因和其它降解酶的基 26 因轉(zhuǎn)入同一個(gè)質(zhì)粒內(nèi)，構(gòu)建所謂的超級(jí)菌。四種農(nóng)藥對(duì)土壤脫氫酶在影響 [J].環(huán)境化學(xué)， 2020, 19(6):523527 [13] 王永杰，李順鵬，沈標(biāo)等．有機(jī)磷農(nóng)藥光譜活性降解菌的分離及其生理特性的研究 [J]．南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 1999， 22(2)： 42—45. [14] 陳亞麗 張先恩 劉虹 .甲基對(duì)硫磷降解菌假單胞菌 WBC3 的篩選及其降解性能的研究 [J]. 微生物學(xué)報(bào) ,2020 ,42(4):490497. 28 [15] Omar SA. Availability of phosphorus and sulfur of insecticide origin by fungi[J]. B iodegradation, 1998, 9 (5) : 327～ 336. [16] Sikora LJ, Kaufman D, HornogLC. Enzyme activity in soils showing degra dation of anophosphosphate insecticides[J]. B iol amp。在此謹(jǐn)向恩師致以最衷心的感謝 ! 在實(shí)驗(yàn)過程中，得到了趙亞玲老師和夏天師姐的鼎力相助 。 姜廣正 . 鐮孢霉屬 (Fusarium)真菌鑒定方法 [J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版 )， 1984,01:5968. 29 致 謝 本研究課題從選題到論文的審閱定稿，都是在惠有為老師的悉心指導(dǎo)和親切關(guān)懷下完成的。利用微生物的辦法來治理有機(jī)磷農(nóng)藥的污染，實(shí)現(xiàn)人與自然地和諧共處。 (2)分離純化菌株產(chǎn)生的降解酶，進(jìn)行降解酶固定化的研究，從而實(shí)現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥廢水的生物治理，這也是以后值得研究和開發(fā) 。 (1) 本研究采用農(nóng)藥廠附近土壤為菌源，通過馴化、篩選，分離得到 5株可有效降解有機(jī)磷農(nóng)藥的優(yōu)勢菌種，其中 3株為細(xì)菌， 2株為真菌，觀察菌株的培養(yǎng)特征和個(gè)體形態(tài)，根據(jù)文獻(xiàn) [18,19]初步鑒定， 3株細(xì)菌 均為假單胞菌屬 (Pesudomon as)， 2株真菌均為鐮孢霉屬 ( Fusarium LK. ex Fx)。在 30℃ 、 160 r/min 條件下培養(yǎng) 24h 后于波長 600 下測量吸 24 光度。 由圖 (a)、 (b)可知，在所試的溫度范圍內(nèi)， 5株菌株均有不同程度的生長，其中細(xì)菌溫度為 37℃ 、真菌溫 度為 30℃ 時(shí)的生長情況最佳，溫度過高或過低都不利于其生長。 由圖 (b)可知，菌株 Z01的最適 pH值為 ，菌株 Z02的最適 pH值為 。 由圖 (a)、 (b)可知，葡萄糖對(duì)降解菌的生長有促進(jìn)作用，且葡萄糖濃度越高時(shí)，菌株的生長越旺盛。 由圖 3. 1(b)可知，降解菌中的真菌最適碳源為葡萄糖，其他的幾種碳源也是真菌生長可選擇的較優(yōu)碳源，可見 2 株真菌降解菌對(duì)碳源的適用范圍較廣。 菌株生長特性 不同碳源對(duì)菌株生長的影響 試驗(yàn)選 取培養(yǎng)液的碳源分別為蔗糖、葡萄糖、甲醇、乙醇、丙酮、對(duì)硝基苯酚。 分生孢子梗細(xì)長分枝。 Z01： 菌落白色 ,氣生菌絲呈絨狀 ， 生長比較旺盛 ,常產(chǎn)生紫色色素。 X02: 革蘭氏陽性菌，棒狀、排列不規(guī)則；菌落桔黃色、較大、形狀不規(guī)則、個(gè)別為橢圓形、比較光滑、有光澤、生長尚好、凸起、菌落直徑在 3mm 左右。 18 第三章 結(jié)果與分析 從農(nóng)藥廠土樣出發(fā)，以農(nóng)藥毒死蜱進(jìn)行馴化篩選，分離到 5 株可以降解有機(jī)磷農(nóng)藥的菌株，其中 3 株為細(xì)菌，其余 2 株是真菌，分別編號(hào)為 X0 X0 X0Z0 Z02。 pH試驗(yàn) :將菌種在含有農(nóng)藥的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24h，制成種子液，按 10%的接種量接于含 300mg/L的毒死蜱、 1g/L的葡萄糖的無機(jī)鹽培養(yǎng)基的三角瓶中，該培養(yǎng)基以 NaOH和 H2SO4調(diào)節(jié) pH，令其 pH值分別是 、 、 、 、 。 32℃ 培養(yǎng) 3～ 4d，以不接種菌的培養(yǎng)基和不加糖的培養(yǎng)基為對(duì)照，培養(yǎng)基變黃為陽性。若是只有無凡士林的管內(nèi)產(chǎn)酸而有凡土林覆蓋的管內(nèi)卻無變 化或表面微見生長，即為氧化產(chǎn)酸。培養(yǎng) 2， 3， 5， 7， 14 天后觀察記錄紙條是否變色。 (8) 產(chǎn)生 H2S 試驗(yàn) 每支試管裝 5mL 液體培養(yǎng)基（牛肉膏 3g，酵母浸膏 3g，蛋白胨 10g， FeSO4 ， NaCl 5g，硫代硫酸鈉 ，蒸餾水 1000mL， ）。在 V． P 試驗(yàn)時(shí)候。如果得到可疑的結(jié)果應(yīng)重復(fù)測定，并在室溫培養(yǎng) 7 天。如培養(yǎng)液中有吲哚，可被提取在乙醚層中，濃縮的吲哚與試 15 劑反應(yīng)，則顏色明。 (5) 吲哚試驗(yàn) 培養(yǎng)基 :每支試管裝 5mL 液體培養(yǎng)基 (蛋白胨 10g，牛肉膏 5g， NaCL 5g，)，滅菌，將被測菌接種于上述培養(yǎng)基中，留一無接種管對(duì)照。培養(yǎng) 17 天后，當(dāng)有明顯菌苔的長出之時(shí)，打開培養(yǎng)皿蓋，滴入少量的碘液，輕輕地旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿使碘液均勻地鋪滿整個(gè)平板。如果有菌生長，菌苔下的明膠表面也有凹陷，小窩(須與未接種的對(duì)照管比較，因明膠培養(yǎng)過久，水分的蒸發(fā)也會(huì)產(chǎn)生凹陷 )為輕度水解，按陽性記錄。用穿刺法以無菌操作技術(shù)將檢驗(yàn)的微生物接種于試管明膠培養(yǎng)基中，并做兩管不接種的作對(duì)照。 生理生化特征測定 (1)革蘭氏染色 先用初染劑結(jié)晶紫進(jìn)行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇脫色，最后用復(fù)染劑番紅復(fù)染。晾干后滴加黑色素 l 滴于載玻片一端，用另一邊緣平整的載玻片將黑色素刮過涂片，使成一薄層，晾干后鏡檢，菌體紅色。7H2O、 (NH4)2SO4 、 K2HPO4 西安化學(xué)試劑廠 NaCl、 NaOH、 HCl、 95%乙醇 西安化學(xué)試劑廠 無水乙醇、甲醇、丙酮 西安化學(xué)試劑廠 毒死蜱 美國陶氏益農(nóng)公司 30%H2O2 天津市化 學(xué)試劑六廠 溴百里香酚藍(lán) 上?？笊锛夹g(shù)有限公司 尿素、檸檬酸鈉 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司 明膠 青島化學(xué)試劑廠 甲基紅 天津市東方衛(wèi)生材料廠 乙醚、硫代硫酸鈉 西安化學(xué)試劑廠 半乳糖 上海試劑二廠 表 儀器及設(shè)備 Table Instruments and equipment 儀器名稱 及型號(hào) 生產(chǎn)廠家 SWCJ1G型單人凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司 LRH250Ⅱ 生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠 LDZX75KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠 HZQF全溫振蕩培養(yǎng) 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司 實(shí)驗(yàn)室 pH計(jì) 梅特勒 托利多儀器（上海）有限公司 722光柵分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司 XSZ2GA光學(xué)顯微鏡 重慶光電儀器有限公司 13 菌種的鑒定 2． 2． 2． 1 形態(tài)特征 （ 1） 菌落特征 將菌接種于牛肉膏平板培養(yǎng)基上， 32℃ 恒溫培養(yǎng) 48h，觀察菌體和菌落 [21]。 2天后，挑取有明顯透明圈的菌落劃線轉(zhuǎn)移至農(nóng)藥濃度提高的新鮮富集培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 2天，連續(xù) 5次轉(zhuǎn)接直至富集培養(yǎng)基中農(nóng)藥濃度提高到 480mg/L。 選擇培養(yǎng)基 (瓊脂平板 )：在富集培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入 100mg/L的毒死蜱。7H2O 0. 2g ， CaSO4表 [20]為部分菌種和其能夠降解的農(nóng)藥。這是目前世界上還未有商品化生產(chǎn)的有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶產(chǎn)品以及在生產(chǎn)實(shí)踐上推廣應(yīng)用的關(guān)鍵原因。陳亞麗 (2020)[14]等從一株假單胞桿菌 WBC3 中分離到降解甲基對(duì)硫磷的有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶，已進(jìn)行 X－衍射分析其三維結(jié)構(gòu)。這些研究使得關(guān)于有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶的認(rèn)識(shí)得到進(jìn)一步深入，酶學(xué)機(jī)理得到進(jìn)一步了解。 Munnecke 等分離到的有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶對(duì)試驗(yàn)用的甲基對(duì)硫磷、對(duì)硫磷、二嗪農(nóng)、毒死蜱等 7 種有機(jī)磷農(nóng)藥均能有效降解，在 22℃ 時(shí)降解效率比化學(xué)降解快 10002450 倍，且該酶不為農(nóng)藥及農(nóng)藥制劑中溶劑所抑制，對(duì)環(huán)境條件有較寬的忍受范圍。其中兩株對(duì)硫磷降解菌 Flavobacterium (Walter ,1980)和 Pesudomonas diminuta GM( McDaniel,1988)的降解酶得到了深入細(xì)致的研究，分離得到了降解酶基因（ opd），比較發(fā)現(xiàn)兩者基因具有很強(qiáng)的同源性，并且這兩株菌的降解酶基因都定位于細(xì)菌內(nèi)的大質(zhì)粒上。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這些微生物之所以能降解有機(jī)磷農(nóng)藥是因?yàn)樗鼈兡芊置谝?種能水解磷