【正文】 ，且粘度界面張力小或適中，有利于相的分散和兩相分離； (4)溶劑的回收和再生容易； (5)化學(xué)穩(wěn)定性好，不易分解，對設(shè)備腐蝕性??； (6)經(jīng)濟(jì)性好．價廉易得； (7)安全性好，閃點(diǎn)高，對人體無毒性或毒性低。 分離因數(shù) (β ) 萃取劑對溶質(zhì) A 和 B 分離能力的大小可用分離因數(shù) (β )來表征： 若原來料液中除溶質(zhì) A 以外，還含有溶質(zhì) B，則由于 A、 B 的分配系數(shù)不同，萃取相中 A 和 B的相對含量就不同于萃余相中 A 和 B 的相對含量。必須考慮這些物質(zhì)對萃取過程的影響。 (2)溫度 溫度會影響生化物質(zhì)的穩(wěn)定性，所以一般在室溫或低溫下進(jìn)行。 (4)帶溶劑 能和產(chǎn)物形成復(fù)合物，使產(chǎn)物更易溶于有機(jī)溶劑相中，提高分配系數(shù)。 （ 2）多級逆流萃取，特點(diǎn)：萃取劑消耗少，萃取液產(chǎn)物平均濃度高，產(chǎn)物收率最高。蛋白質(zhì)是引起乳化的最重要的表面活性物質(zhì)。 最好的方法是防止乳化，如蛋白質(zhì)是乳化起因，就應(yīng)設(shè)法去除蛋白質(zhì)。 超臨界流體 ： 是狀態(tài)超過氣液共存時的最高壓力和最高溫度下物質(zhì)特有的點(diǎn) ——臨界點(diǎn)后的流體。 物質(zhì)之間的溶解能力主要取決于物質(zhì)分子之間的相似性，一是分子結(jié)構(gòu)相似，二是分子間的作用力相似。 在超臨界萃取后的分離操作中．可在與萃取溫度相同的條件下，降低壓力使溶劑的密度下降， 21 引起其溶解物質(zhì)的能力下降，就可以方便地進(jìn)行萃取物與溶劑的分離。 ２、萃取溶劑 CO2 的性質(zhì)： 無毒，無腐蝕性，不可燃燒，純度高且價格低。 ２、拖帶劑的作用： 添加拖帶劑即輔助溶劑，可增加物質(zhì)的溶解度和萃取選擇性。溶質(zhì) 2 在氣相中的逸度系數(shù) ?2 對其影響最大；溶質(zhì)與溶劑之間相互作用能越大， E 就越大。 ②產(chǎn)品回收時，不需要處理大量的稀水溶液，因而不產(chǎn)生廢水污染問題。 ② SC—CO2 對細(xì)胞壁中的少量脂類有萃取作用，會破壞細(xì)胞壁的化學(xué)結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞壁在某些位置上的損壞。于是有可能將水溶性的酶、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)從一個水相轉(zhuǎn)移到另一水相中，從而完成分離任務(wù)。 嫡的增加涉及到分子數(shù)量，與分子大小無關(guān)。大分子間混合，分子間作用力決定混合效果。雙節(jié)線下方為一相區(qū)，雙節(jié)線上方即為兩相區(qū)，兩相分別有不同的組成和密度。 CT K= —— CB Ct、 CB——分別代表上相、下相中溶質(zhì)的濃度 K——與溫度、壓力以及溶質(zhì)和溶劑的性質(zhì)有關(guān)，與溶質(zhì)的濃度無關(guān)。 雙水相提取胞內(nèi)酶的具體操作 基本流程：（圖、表） 1 ． 萃取和平衡 2．上下相的分離 (1)重力沉降 (2)離心分離（圖） 3．多聚物的分離 三、 雙水相蘋取技術(shù)的發(fā)展 雙水相萃取應(yīng)用得最多的是胞內(nèi)酶的提取。是一種自我組織和排列而成的，并具熱力學(xué)穩(wěn)定的有序構(gòu)造。其親水性的極性端向外指向水溶液，疏水性的非極性 “尾 ”向內(nèi)相互聚集在一起。 表面活性劑的類型： 陰離子型； 陽離子型； 非離子型。 (圖 ) 五、 在液膜分離法中的應(yīng)用 利用含有反膠團(tuán)的有機(jī)相作為液膜，從一水相中向另一水相擇性地輸送生理活性物質(zhì)的液膜分離方法，和通常的液液 萃取法相比，具有以下一些特征： 正萃取和反萃取能同時在一個裝置內(nèi)進(jìn)行； 表面活性劑的使用量及其損失較少； 從原理上來看，速度差分離也是可能的。 一、浸取過程的應(yīng)用 前加工： 干燥：有助于細(xì)細(xì)胞膜的破裂，溶劑也容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部直接溶解溶質(zhì)。 一般而言．第一、二兩步都很迅速，不是浸取過程總速率的控制性步驟。 4．固體原料的頂處理： 如粉碎、干燥等。 Cell theory 研究進(jìn)展和參考資料 韓貽仁．分子細(xì)胞生物學(xué)．第二版．北京：科學(xué)出版社， 2020 汪堃仁，薛紹白，柳惠圖．細(xì)胞生物學(xué)．第二版．北京：北京師范大學(xué)出版社， 1998 課后復(fù)習(xí)題 縱觀 cell biology 發(fā)展簡史，你認(rèn)為該學(xué)科近百年來快 速發(fā)展的主要原因是什么？ 27 第六章 沉淀法和吸附法 第一節(jié)、沉淀法 一、鹽析法； 二、有機(jī)溶劑沉淀法； 三、等電點(diǎn)沉淀法； 四、生成鹽復(fù)合物沉淀法。 ②有機(jī)溶劑沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸等產(chǎn)品的分離純化，也有用于蛋白質(zhì)的沉淀。 IogS＝ 223。 2） 離子強(qiáng)度和種類的影響：離子強(qiáng)度越大，蛋白質(zhì)的溶 解度越低。但在高鹽濃度中，蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)的溶解度隨溫度的升高反而減小。 中性鹽的濃度增加時，相 應(yīng)于最低溶解度的 pH 值向偏酸方向移動；同時最底溶解度會有所增大。 缺點(diǎn)：酸化時，容易引起蛋白質(zhì)失活，因為蛋白質(zhì)對低 PH 比較敏感。 缺點(diǎn)：容易引起蛋白質(zhì)變性失活，有機(jī)溶劑易燃、易爆，對安全要求較高。 溫度：降低溫度可以增加收率。 樣品濃度和分子質(zhì)量：低濃度樣品需用有機(jī)溶劑的量較大，但共沉作用小，有利于提高分離的效果；但低濃度樣品損失較大，回收率低，具有生理活性的樣品容易產(chǎn)生稀釋變性。利用 檸檬酸鈣難溶于水的特點(diǎn)，與雜質(zhì)分離的過程。 一、 吸附過程的基礎(chǔ)理論 吸附作用：物質(zhì)從流體相 (氣體或液體 )濃縮到固體表面的過程。 吸附作用力也是范德華力．它是一組分子引力的總稱，包括三種力，即定向力、誘導(dǎo)力。 吸附物：被吸附的物質(zhì)。 生產(chǎn)設(shè)備及操作 1）調(diào)漿：調(diào)漿罐， 30—50%濃度； 2）中和：中和罐，濾液、鈣漿泵入，攪拌， 7090℃ ，控制 終點(diǎn)； 3）過濾：過濾槽、帶式過濾機(jī)， 90℃熱水逆流洗滌； 4）酸解：酸解罐，攪拌，稀酸調(diào)漿，加熱，加硫酸，控制終點(diǎn)； 5）過濾：過濾槽、帶式過濾機(jī)， 90℃熱水逆流洗滌，至 PH 大于 4。但離子強(qiáng)度過大，不利分離。因此在接近等電點(diǎn)處，以引起沉淀所需有機(jī)溶劑的量較少。 對同一種溶劑，蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量越大，沉淀所需有機(jī)溶劑的量越少。其主要作用是降低水溶液的介電常數(shù)。許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)都在偏酸性的范圍內(nèi)。由于蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時最易沉淀，可選擇等電點(diǎn)的 PH 作為鹽析的 pH?？捎貌煌柠}濃度將各種蛋白質(zhì)分別沉淀析出。值 —是溶質(zhì)的特征常數(shù)，對于蛋白質(zhì)而言，其大 小主要取決于不同蛋白質(zhì)的性質(zhì)，它也與溶液的溫度和 pH 值有關(guān)，但與鹽的種類無關(guān)； 為便于計算，用鹽的摩爾數(shù) m 代替離子強(qiáng)度Ⅰ，則 IogS＝ 223。 ④生成鹽復(fù)合物沉淀法：用于多種化合物，特別是小分子物質(zhì)的沉淀。 優(yōu)點(diǎn)：成本低、設(shè)備簡單、收率高、濃縮倍數(shù)高和操作簡單。 教學(xué)方法 講授；多媒體教學(xué) 主要 教學(xué)內(nèi)容 Section 1:沉淀法 ◆ 鹽析法 ◆ 有機(jī)溶劑沉淀法 ◆ 等電點(diǎn)沉淀法 ◆ 生成鹽復(fù)合物沉淀法 Section 2: 吸附法 ◆ 吸附過程的基礎(chǔ)理論 ◆ 吸附類型 ◆ 影響吸附過程的因素 ◆ 大網(wǎng)格聚合物吸附 需掌握的專業(yè)詞匯 Cell。 三、浸出的其他問題 25 1．相平衡 浸取過程中的相平衡用分配系數(shù) KD 表示 KD ＝ y / x y——達(dá)到平衡時溶質(zhì)在濃相中的濃度 x——平衡時溶質(zhì)在固相中的濃度 2．溶劑的選擇 KD 大且對目的物質(zhì)的選擇性高，溶劑的價格應(yīng)低廉，無腐蝕性，無毒，閃點(diǎn)高，無爆炸性，產(chǎn)品中易去除 ,容易回收。 切片：減小水溶劑從水相主體擴(kuò)散到每個細(xì)胞的距離，細(xì)胞基本上保持完好，水溶性物質(zhì)可以通過半透性細(xì)胞膜擴(kuò)散進(jìn)入水溶劑中，蛋白質(zhì)和膠體組分因透不過細(xì)胞膜而不能溶入水相。 有研究表明，用容積 (Bulk)液膜的形式，反膠團(tuán)萃取分離蛋白質(zhì)和核酸是可能的。 反膠團(tuán)的物理化學(xué)特性及制備 （ 1）．反膠團(tuán)的物理化學(xué)特性 ① 反膠團(tuán)的臨界膠團(tuán)濃度 24 ② 反膠團(tuán)含水率 W （ 2 ）．反膠團(tuán)的制備 ①注入法 ②相轉(zhuǎn)移法 ③溶解法 三、 生理活性物質(zhì)的分離農(nóng)縮 反膠團(tuán)萃取原理 蛋白質(zhì)的溶解 反膠 團(tuán)萃取 1） 氨基酸分離特性 2）酶、蛋白質(zhì)萃取特性 ①靜電性相互作用 ②立體性相互作用 ③其他的相互作用 四、 在分離工藝中的應(yīng)用 通過三步分離操作分離了核糖核酸酶 a、細(xì)胞色素 c 和溶菌酶。與在水相中不同的是，其疏水性的非極性尾部向外，指向非極性溶劑，而極性頭向內(nèi)，與在水相中形成的微膠團(tuán)方向相反，因而稱之為反膠團(tuán)或 反向膠團(tuán)。 反膠團(tuán)萃取的優(yōu)點(diǎn)： (1)有很高的萃取率和反蘋取率并具有選擇性； (2)分離、濃縮可同時進(jìn)行，過程簡便； (3)能解決蛋白質(zhì) (如胞內(nèi)酶 )在非細(xì)胞環(huán)境中迅速失活的問題； (4)由于構(gòu)成反膠團(tuán)的表面活性劑往往具有細(xì)胞破壁功效，因而可直接從完整細(xì)胞中提取具有活性的蛋白質(zhì)和酶； (5)反膠團(tuán)萃取技術(shù)的成本低，溶劑可反復(fù)使用等。 PEG 衍生物：在 PEG 上引入親和基團(tuán)或離子基團(tuán)；采用多級萃取。 23 二、 雙水相萃取技術(shù)的應(yīng)用 雙水相萃取技術(shù)目前較多地應(yīng)用于胞內(nèi)酶的提取和精制上。由圖 72 可知，上相主要含 PEG， 下相主要含 Dex。 相圖 水性兩相的形成條件和定量 關(guān)系常用相圖表示。 分子間的作用力可看作分子中各基團(tuán)間相互作用力之和。 另外，某些聚合物的溶液與某些無機(jī)鹽的溶液相混合時，只要濃度達(dá)到一定值，也會形成兩相，即聚合物 —鹽雙水相體系，成相機(jī)理尚不清楚，一種解釋為 “鹽析 ”作用。 ③ SC—CO2 節(jié)流膨脹是吸熱降溫過程，這個性質(zhì)可防止通常破碎過程升溫而引起的熱敏性物質(zhì)的破壞。 22 ④與萃取一樣， SC—C02 中的質(zhì)量傳遞速度快，在臨界點(diǎn)附近，溶解能力和介電常數(shù)對溫度和壓力敏感，可控制反應(yīng)速度和反應(yīng)平衡。代表性的三種流程的模式圖。純 C02 幾乎不能從咖啡豆中萃取咖啡因，但在加濕 (水 )的SC—C02 中，因為生成 了具有極性的 H2CO3，在一定的條件下，能選擇性地溶解萃取極性的咖啡因。 四、 SC—C02 萃取以及拖帶劑的作用 １、 SC—C02 萃?。? 天然產(chǎn)品中通常含有許多不同的化學(xué)成分；對同一天然產(chǎn)品用不同方法或不同萃取劑提取得到的制品，其組分是不同的。由于 CO2 溶解、萃取物質(zhì)的能力與 CO2 本身的密度成正比，這就意味著只要通過改變壓力或溫度來改變?nèi)軇?CO2 的密度，就可以改變其對物質(zhì)的溶解能力。真空或萃取劑分子密度極低，溶劑對溶質(zhì)的作用能極小，溶質(zhì)的溶解度也就極小了。 二、 超臨界流體的蘋取原理 真空 “溶解 ”物質(zhì)的能力極低。混合、萃取和分離也可在同一臺設(shè)備 (如 Alfa—Laval 萃取機(jī) )內(nèi)完成。親水基團(tuán)強(qiáng)度大于親油基團(tuán)。 害處：乳化產(chǎn)生后會使有機(jī)溶劑相和水相分層困難，發(fā)酵液廢液中夾帶有機(jī)溶劑微滴和溶劑相中央帶發(fā)酵液的微滴，前者意味著發(fā)酵單位的損失；后者會給以后的精制造成困難 。 二、工業(yè)萃取方式和理論收得率 工業(yè)上萃取操作通常包括三個步驟： (1)混合 (2)分離 (3)溶劑回收 20 1．單級萃取 萃取操作理論收得率的計算須符合以下兩個假定： (1)萃取相和萃余相很快達(dá)到平衡，即每一級都是理論級； (2)兩相完全不互溶，在分離器中能完全 分離。 (3)鹽析 硫酸銨、氯化鈉等可降低產(chǎn)物在水中 的溶解度，有機(jī)溶劑在水相中的溶解度。對選擇性有影響。 β 越大， A、 B 的分離效果越好，即產(chǎn)物與雜質(zhì)越容易分離。如果是稀溶液，活度可用濃度代替，則達(dá)到平衡時溶質(zhì)在兩相中的濃度之比為一常數(shù)。物質(zhì)的介電常數(shù)可通過測定該物質(zhì)在電容器 二極板間的靜電容量 C 來決定。 3．溶劑的極性 溶劑萃取的關(guān)鍵是萃取溶劑的選擇，而選擇的依據(jù)是 “相似相溶 ”的原則。 (3)B 型溶劑 只有電子供體的溶劑，如酮、醛、醚、酯等，萃取溶劑中的 TBP(磷酸三丁酯 )、叔胺 19 等。氫鍵力與化合鍵能相比較弱，但比范德華力要強(qiáng)得多。此過程需要吸收能量，這種能量的大小通常與分子之間的作用力有關(guān)，一般順序為： 非極性物質(zhì)＜極性物質(zhì)＜?xì)滏I物質(zhì)＜離子型物質(zhì) (2)溶劑 A 在溶質(zhì) B 的作用下形成可容納 B 質(zhì)點(diǎn)的空位；此過程也需要吸收能量，其大 小與溶劑分子 A 之間的相互作用力有關(guān)，一般順序與上述相同：