【正文】 晰的條帶。 有時還會出現三條帶 ， 其中一條是因為有一些質粒 DNA在提取過程中遭到損傷而線性化 ， 其移動速度介于螺旋狀和超螺旋狀質粒 DNA之間 ， 所以該條電泳帶位于上述兩種帶之間 。 ? 在提取緩沖液中加一定量的氯苯 (1/2體積 )，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖 。 對 策 原因 1. 實驗材料不佳或量少 2. 破壁或裂解不充分 3. 沉淀不完全 4. 洗滌時 DNA丟失 1. 盡量選用新鮮（幼嫩）的材料 2. 動植物要勻漿研磨充分； G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或機械方式破壁 3. 高溫裂解時，時間適當延長（對于動物細胞、細菌可增加 PK的用量） 4. 低溫沉淀，延長沉淀時間 5. 加輔助物，促進沉淀 6. 洗滌時，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒 DNA提取常見問題 ?問題三： DNA提取量少。 ? 裂解變性 ： 異硫氰酸胍 （ 亞硫氫胍，巰基乙醇， N月桂肌氨酸等）。 ? 洗滌： 70％乙醇。 RNA提取的通用方法 RNA提取實例 大豆總 RNA的提取 1) 配制提取液 異硫氰酸胍 (4mol/l) 4ml 苯酚 3ml 醋酸鈉 (2mol/l ) 氯仿 PVP 2) 將研缽放在 80℃ 冰箱中預冷，取 30天的未成熟種子放入研缽中，加入液氮，迅速將花生豆研磨成粉末狀，轉移至提取液中，混勻，冰浴 30min。 RNA提取的通用方法 影響 RNA提取的因素 ? 材料 ： ? 新鮮，切忌使用反復凍融的材料 ? 如若材料來源困難，且實驗需要一定的時間間隔。 建議在液氮條件下將組織碾碎 ， 并且勻漿時使用更多裂解液 。 ? 減少起始樣品量 ， 確保裂解完全 、 徹底 ? 解決辦法 :重新抽提一次 ， 再沉淀 ， 溶解 。 ? 解決辦法 :再沉淀一次后 ， 溶解 。 用水作為稀釋液將導致比值的降低 。端沒有互補序列的引物 優(yōu)化鎂離子濃度 可能原因 解決方案 RT常見問題分析和解決方案 問題三： 產生彌散（ smear）條帶 ? 第一鏈產物的含量過高 ? PCR反應中引物過多 ? 循環(huán)數過多 ? 退火溫度過低 ? 寡核苷酸片段產生的非特異性擴增 常規(guī) PCR步驟中減少第一鏈產物的量 減少引物的用量 減少 PCR的循環(huán)次數 提高退火溫度 提取高質量 RNA，防止被 DNA污染 可能原因 解決方案 謝謝！ 。 ? 變性電泳條帶變淡： ? EB 與單鏈的結合能力要差一些，故同樣的上樣量，變性電泳比非變性電泳要淡一些； ? 甲醛的質量不高 。 此范圍線性最好 。 ? 解決辦法 :重新抽提一次 ， 再沉淀 ， 溶解 。 樣品要相對小一點； ? 先用液氮研磨 ， 再加裂解液勻漿； ? 樣品與裂解液充分接觸前避免融化 ， 研磨用具必須預冷 ， 碾磨過程中及時補充液氮 。期間動作快速，樣品保持冷凍 ? 樣品量適當，保證充分裂解 ? 為減少 DNA污染，可適當加大裂解液的用量 提取的因素? 純化： ? 在使用氯仿抽提純化時，一定要充分混勻，且動作快速； ? 經典的純化方法，如 LiCl 沉淀等，雖然經濟，但操作時間長，易造成 RNA 降解； ? 柱離心式純化方法：抽提速度快，能有效去除影響 RNA 后續(xù)酶反應的雜質，是目前較為理想的選擇。 4) 取上清，加入等體積的苯酚 :氯仿 :異戊醇（ 25:24:1）， 4℃ ， 12022rpm,離心 5min. RNA提取的通用方法 5) 取上清，加入 3mol/l KAc(),混勻，冰浴 30min, 4℃ ，13000rpm,離心 15min. 6) 取上清，加入 2倍體積無水乙醇， 20℃ 放置 1h, 4℃ ， 8000rpm,離心13min。 乙酸鈉（ ）：維持變性的細胞裂解液的 pH值，沉淀 RNA。 ? 純化分離： 苯酚，氯仿，異戊醇。 ? 有機溶劑抽提，沉淀，得到純凈 RNA。 核酸分離、純化 ?多酚的去除： ? 在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑： β 巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等 ? 加入易與酚類結合的試劑：如 PVP、 PEG(聚乙二醇 )，它們與酚類有較強的親和力，可防止酚類與 DNA的結合 核酸分離、純化 ?鹽離子的去除： ? 70％的乙醇洗滌 核酸沉淀、溶解 ? 當沉淀時間有限時，用預冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分 ? 沉淀時加入 1/10體積的 NaAc（ ， 3M），有利于充分沉淀 ? 沉淀后應用 70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等 ? 晾干 DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥） ? 若長期儲存建議使用 TE緩沖液溶解 ? TE中的 EDTA能螯和 Mg2+或 Mn2+離子，抑制 DNase ? pH值為 ，可防止 DNA發(fā)生酸解 基因組 DNA的提取 質粒 DNA的提取 1. DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質 2. DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應 3. DNA中殘留有金屬離子 1. 重新純化 DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質（具體方法見前） 2. 重新沉淀 DNA，讓酒精充分揮發(fā) 3. 增加 70％乙醇洗滌的次數（ 23次） DNA提取常見問題 ?問題一： DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和 PCR反應。 Relaxed circle Supercoiled form 第一部分： DNA提取方法簡介 第二部分： DNA提取常見問題、 原因分析及其對策 內容 第三部分： RNA提取方法簡介 第四部分： RNA提取及其 RTPCR常見 問題、原因分析及其對策 DNA提取的基本步驟 －內容物釋放 、純化 ，并去除雜質 材料準備 ? 最好使用新鮮材料， 低溫保存的樣品材料不要反復凍融 ? 提取血液基因組 DNA時，要選擇有核細胞（白細胞） ? 組培細胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成 DNA降解 ? 含病毒的液體材料 DNA含量較少，提取前先富集 基因組 DNA的提取 質粒 DNA的提取 ? 使用處于對數期的新鮮菌體（老化菌體導致開環(huán)質粒增加） ? 培養(yǎng)時應加入篩選壓力，否則菌體易污染，質粒易丟失 ? 盡量選擇高拷貝的質粒，如為低拷貝或大質粒，則應加大菌體用量 ? 菌株不要頻繁轉接（質粒丟失） 細胞裂解