植物組織培養(yǎng)基本操作(文件)
【正文】 有微生物滋生 ， 從而影響培養(yǎng)效果 。對于培養(yǎng)過程中可能出現(xiàn)內(nèi)生菌污染的材料，應(yīng)盡量取生長旺盛期的生長點部位作為起始培養(yǎng)的材料。 ⑶控制濕度 給供體植株澆水時應(yīng)從根部給水，避免從上部澆水，以免上部形成易于病原侵染的濕度環(huán)境；盡可能降低溫室濕度；取材前盡可能保持植株干爽。 胚胎培養(yǎng)或脫毒在 。 二、預(yù)處理與表面滅菌 預(yù)處理 先對植物材料進(jìn)行修剪整理，去掉不需要部分，將準(zhǔn)備使用的植物材料（外植體）在流水中沖洗 2060分鐘，備用。 （ 2） 操作期間雙手和臺面常用 70%酒精或消毒劑擦拭 。滅菌時需進(jìn)行攪動。 （ 1）借助接種用工具將材料切割分離。 （ 5）工作人員操作時禁止不必要的談話。 一 、 外植體的培養(yǎng)條件 光照 光照對植物生長發(fā)育有重要作用 ， 是離體培養(yǎng)中非常重要的環(huán)境因素 。 培養(yǎng)室溫度是 25177。 濕度 培養(yǎng)瓶內(nèi)相對濕度通常是 100%，而環(huán)境中的相對濕度會直接影響培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)。 振蕩培養(yǎng)是解決通氣的良好辦法 。 愈傷組織 莖 根 植株 。 愈傷組織上發(fā)生 。 （ 三 ） 外植體 直接形成根與芽 植株 。 污染途徑： 外植體帶菌 培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹底 操作人員未遵守操作規(guī)程 ⑵真菌污染的特點 污染部分長有不同顏色的霉菌，接種后 310天發(fā)現(xiàn)。 接種時除去外部韌皮組織，只接內(nèi)部的分生組織。 （二）外植體的 褐變 及其防止措施。 ⑶培養(yǎng)基的成分 過高的無機鹽濃度 生長調(diào)節(jié)物質(zhì)使用不當(dāng)， BA過多 分生能力強的材料，氧化受抑制，褐變也被抑制 培養(yǎng)條件不適宜，溫度過高或光照過強，褐變加速。 ⑶加抗氧化物。 ⑵瓊脂濃度 瓊脂濃度低，玻璃化苗增加。 ⑥離子水平 植物種類不同，離子形態(tài)比例量要求不同。⑸適溫生長，熱擊處理防止玻璃化發(fā)生。 試管苗長期生活在密閉容器中，形成其獨特生態(tài)系統(tǒng)，與外界環(huán)境相比，有四大差異 ⑴高恒溫 試管苗整個生長過程中采用的是恒溫培養(yǎng)，溫差很小。 ⑶弱光 試管瓶內(nèi)光照一般比太陽光弱，幼苗生長也較弱，不能受太陽光直接照射。 馴化方法 將長有完整試管苗的培養(yǎng)瓶由培養(yǎng)室轉(zhuǎn)到伴遮蔭的自然光下鍛煉，并打開瓶蓋注入少量自來水使幼苗逐漸降低溫度，轉(zhuǎn)向有菌，一般進(jìn)行 12周。 嫁接移栽優(yōu)點： 移栽成活率高。 四、提高試管苗移栽成活率的途徑 壯苗移栽比弱苗移栽成活率高 生長素（ NAA）利于生根 低無機鹽濃度生根效果好 活性炭利于嫩莖生根 避免太陽直射，溫度 2530℃ ，濕度在85%以上 使試管苗逐漸從無菌向有菌過渡 。 需時間短， 20天成活，緩苗期 1015天。 直接移栽法 直接將試管苗移栽到盆缽的方法。 試管苗特點 ⑴試管苗生長細(xì)弱、莖葉表面角質(zhì)層不發(fā)達(dá) ⑵葉綠體的光合作用較差 ⑶葉片氣孔數(shù)目少，活性差 ⑷根的吸收功能差 ⑸對逆境的適應(yīng)性和抵抗能力較差 二、試管苗的馴化 馴化的目的 提高試管苗對外界環(huán)境條件的適應(yīng)性，提高光合能力，使試管苗健壯，提高試管苗移栽成活率。 外界環(huán)境條件溫度不斷變化，其調(diào)節(jié)由太陽輻射決定，溫差很大，而且一般不會達(dá)到 25+2℃ 。 ⑺培養(yǎng)基中加入間苯三酚、根皮苷或多效唑、矮壯素。 ⑵提高蔗糖和瓊脂濃度 ⑶降低細(xì)胞分裂素和赤霉素濃度，增加生長素比例。 ⑷光照時間 一般要求 1012h，大于 15h玻璃苗增加。 %活性炭 （三） 玻璃化 現(xiàn)象及其預(yù)防措施 玻璃化現(xiàn)象及其產(chǎn)生原因 玻璃化是在細(xì)胞生長過程中的環(huán)境產(chǎn)生變化，試管苗為了適應(yīng)變化了的環(huán)境而呈玻璃狀。 褐變的防止措施 ⑴選擇適宜的外植體及最佳培養(yǎng)基。 ⑴基因型 某些植物酚類物質(zhì)含量較多。 ⑶器皿與金屬器械的滅菌 玻璃器皿可采用濕熱滅菌或干熱滅菌 金屬器皿一般火焰滅菌，也可干熱滅菌 ⑷布質(zhì)制品的滅菌 濕熱滅菌 ⑸無菌操作室的滅菌 2%新捷爾滅或 70%酒精擦拭（噴霧），紫外燈照射，定期甲醛和高錳酸鉀熏蒸。無糖營養(yǎng)液或自來水使枝條抽枝，以新抽嫩枝作外植體。 病原菌：細(xì)菌及真菌兩大類。 小孢子發(fā)生 。 （ 二 ） 外植體 胚狀體 植株 。 二 、 外植體的成苗途徑 外植體的成苗途徑有三種： （ 一 ） 外植體 愈傷組織 完整植株 。 氧氣 離體培養(yǎng)的試管苗是需要氧氣的 ， 在固體培養(yǎng)或液體靜置培養(yǎng)時 ， 如果組織完全浸入培養(yǎng)基中 ， 與氧氣隔絕 ， 就會停止生長 。 低于 15℃ 時 ， 培養(yǎng)的組織生長停頓 ，高于 35℃ 對生長也不利 。除特殊要求外 ， 一般都采用日光燈作光源 ， 光照強度 10005000Lx， 根據(jù)不同植物或器官需要 ， 可以每天連續(xù)光照 1216小時 ， 也可每天光照 16小時 ， 8小時黑暗 。培養(yǎng)條件是離體培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵 。 （ 3） 迅速將切割分離下的所需組織 、 細(xì)胞、 器官 ， 放入培養(yǎng)基上 ， 及時蓋上瓶蓋 。 常用滅菌劑使用濃度及效果比較表 滅菌劑 使用濃度 持續(xù)時間 去除的難易 效果 次氯酸鈣 910％
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