植物細胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)(文件)
【正文】 ，從其植株葉片上分離的原生質(zhì)體培養(yǎng)效果較佳。 E 蝸牛酶 ，主要用于體細胞原生質(zhì)體分離。酶液配制后需以 um微孔膜過濾除菌，而不可采用加熱滅菌法。 （ 3）純化 需用不銹鋼網(wǎng)或尼龍網(wǎng) (100目一 400目 )濾除較大雜物后再洗滌純化。 （二）原生質(zhì)體培養(yǎng)： 1. 培養(yǎng)方法： （ 1）固體培養(yǎng) ：平板培養(yǎng)法， 1. 2%瓊脂 , 45 oC. （ 2）液體培養(yǎng) ： A. 淺層培養(yǎng)法 : 其過程是將 1m1原生質(zhì)體懸液置于直徑 4cm培養(yǎng)皿或 25m1三角瓶中使成薄層后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．初期振搖 1— 2次，防止粘壁； B. 懸滴培養(yǎng)法 :其過程系將原生質(zhì)體懸液滴入培養(yǎng)皿蓋內(nèi)，其量分別為 5一 50— 100及 100一 200 ul等，保持一定滴距．每皿由幾滴至十幾滴不等，培養(yǎng)皿加入濃度低于培養(yǎng)液的液體，再將皿蓋翻蓋于皿上并置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； C. 雙層培養(yǎng)法 : 先將固體培養(yǎng)基傾入培養(yǎng)皿內(nèi)冷卻成層，再將原生質(zhì)體懸浮液置于已固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)； D. 看護培養(yǎng)法 : 在培養(yǎng)皿底層鋪一層正常密度且經(jīng)射線處理已失去分裂能力而有代謝活力的原生質(zhì)體瓊脂混合物作飼養(yǎng)層，再于其上接種一層低密度 (5一 lo個／細胞／ m1)懸浮原生質(zhì)體培養(yǎng)。經(jīng)后者染色，有細胞壁者發(fā)射綠色熒光。 隨著細胞分裂及細胞團形成，已與常規(guī)細胞和組織培養(yǎng)相同，故培養(yǎng) 3— 4周需添加含一定量低滲穩(wěn)定劑的新培養(yǎng)基，以滿足細胞的營養(yǎng)，亦利于細胞團及小愈傷組織的生長。 (3) 在誘導(dǎo)器官分化過程中，一般采用 15001x左右的高光強。 但由于植物細胞具有堅硬的細胞壁，不能直接融合，需經(jīng)酶消化除去細胞壁釋放出原生質(zhì)體，后者生理、生化及遺傳學(xué)特性與完整細胞基本相同。 （ 1） NaNO3誘導(dǎo) ， NaNO3 可中和原生質(zhì)體表面負(fù)電荷，促進原生質(zhì)體聚集，對原生質(zhì)體無損害，但融合率低； （ 2） 高 Ca2＋ 和高 pH值誘導(dǎo) ，如煙草葉肉原生質(zhì)體于 pH ， mol/LCaCl2 培養(yǎng)基中， 37 ℃ 保溫，融合率可達 25％，并可獲得雜種植株； (3) PEG誘導(dǎo) ，在高濃度 PEG溶液中，原生質(zhì)體發(fā)生聚集作用，經(jīng)稀釋后， 50％以上原生質(zhì)體發(fā)生融合作用，且對多種不同原生質(zhì)體均有效； (4) 高 Ca2+、高 pH值及 PEG結(jié)合誘導(dǎo)法 ，此為方法 (2)和 (3)相結(jié)合的改良法，高 Ca2+和高 pH值對原生質(zhì)體損傷小，但對培養(yǎng)細胞原生質(zhì)體促融作用小于 PEG。 4. 雜種細胞的篩選： （ 1）遺傳互補篩選： （ 2）抗性互補篩選： （ 3）利用物理特性篩選： 2021年 5月 17日 。 融合過程： 23%30% 高密度混合2X105個 /ml 在培養(yǎng)皿內(nèi)進行融合的具體操作是將兩種原生質(zhì)體高密度等體積混合，調(diào)整原生質(zhì)體密度為 2xl0‘個／毫升，混合物滴于直徑為 6cm平皿內(nèi)，每滴 ml，每皿 7— 8滴，靜置 15min，令 原生質(zhì)體貼于平皿底壁，向每滴原生質(zhì)體滴加 30％ PEG溶液，于 15 oC作用 15 min，再用高 Ca2+和高 pH溶液輕輕洗滌原生質(zhì)體，第一次用 ml，第二次用 mL，第三、四次各 用 2m1，每次間 5— 10 min 緩慢吸出上清液，再用培養(yǎng)基洗滌兩次，每次 — ，間隔 5 min, 最后加 — ml培養(yǎng)液．密封平皿后在 26 oC下進行培養(yǎng)。 特點： (1) 可實現(xiàn)遠緣雜交，獲得種間雜種，克服有性雜交配子不親合性； (2) 可獲得含另一親本非整倍體雜種或胞質(zhì)雜種，且獲得的遺傳變異范圍極廣； (3)一次操作可實現(xiàn)兩個以上親本的融合作用 (4) 可獲得呈現(xiàn)雙親個體基因型總和的雜種； (5) 可形成有性生殖障礙植物的種間雜種； 1. 促融因素： 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)過程，有時無需任何處理亦產(chǎn)生融合現(xiàn)象，為自發(fā)融合，但融合率極低。 無根苗轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基上培養(yǎng)生根，其只含低濃度生長素，而不含細胞分裂素，無根苗一旦生根即可發(fā)育成完整植株。當(dāng)愈傷組織達到 1— 2mm時，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)器官分化。不同細胞分裂頻率不同，常在 1％ — 90％之間。可用質(zhì)壁分離法或在稍微低滲溶液中出芽現(xiàn)象證實。此法原生質(zhì)體破碎少。 一步法是將材料在 2l一 28℃ 用纖維素酶及果膠酶混合液一次性處理 2— 24h。2H20(0. 1mmol/l一 10mo1／ l)及 KH2PO4 (0. 75mmol/l)等滲透穩(wěn)定劑，以維持原生質(zhì)體完整性。細胞生長的不同階段及不同物種的細胞壁組成與結(jié)構(gòu)不同，木質(zhì)化及次生加厚的細胞壁不被酶消化，故選擇消化細胞壁的酶類是制備原生質(zhì)體關(guān)鍵。 (一 ) 原生質(zhì)
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