細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)技術(shù)總結(jié)-wenkub
2024-10-29 06 本頁(yè)面
【正文】 生理狀態(tài)下，也發(fā)生于病理狀態(tài)下。線粒體膜勢(shì)能變化的檢測(cè)線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽(yáng)離子熒光染料可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減弱反映了線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度或熒光顯微鏡觀察，拍照正常細(xì)胞中, Rh123 能夠依賴線粒體跨膜電位進(jìn)入線粒體基質(zhì)，熒光強(qiáng)度減弱或消失。AnnexinⅤ(膜聯(lián)蛋白V)是一種分子量為3536KD 的Ca2+ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與PS高親和力。激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)FITCAnnexinV+PI雙染，觀察凋亡過(guò)程中細(xì)胞膜PS表面的變化，并區(qū)分正常細(xì)胞(AnPI)，早期凋亡細(xì)胞(An+PI)，晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞(An+PI+)，細(xì)胞收集過(guò)程中出現(xiàn)的損傷細(xì)胞(AnPI+)。C 固定24h，1%四氧化鋨后固定，丙酮梯度脫水，經(jīng)包埋劑浸透后環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察。凋亡細(xì)胞染色質(zhì)濃縮，邊緣化，核膜裂解，染色質(zhì)分割成塊狀，形成凋亡小體。第一篇：細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)技術(shù)總結(jié)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)技術(shù)總結(jié) 一形態(tài)學(xué)檢測(cè)光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡觀察法未染色細(xì)胞:凋亡細(xì)胞體積變小、變形，膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，晚期出現(xiàn)凋亡小體。熒光顯微鏡檢測(cè)法熒光染料例如，碘化丙啶(PI)是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI 能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。凋亡Ⅰ期的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤(pán)繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象的空泡結(jié)構(gòu)。二、細(xì)胞凋亡的生化及分子生物學(xué)檢測(cè)DNA 斷裂檢測(cè)法如使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，細(xì)胞凋亡時(shí)，核染色質(zhì)凝聚，染色質(zhì)DNA 在核小體單位之間的連接處斷裂。將AnnexinⅤ進(jìn)行熒光素或生物素標(biāo)記，以標(biāo)記了的AnnexinⅤ作為探針，利用流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡以及共聚焦激光掃描顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。而凋亡時(shí)，線粒體膜完整性破壞，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開(kāi)放，引起線粒體跨膜電位的崩潰, Rh123 重新釋放出線粒體, 從而發(fā)出強(qiáng)黃綠色熒光。由于細(xì)胞凋亡對(duì)胚胎發(fā)育及形態(tài)發(fā)生（morphogenesis）、組織內(nèi)正常細(xì)胞群的穩(wěn)定、機(jī)體的防御和免疫反應(yīng)、疾病或中毒時(shí)引起的細(xì)胞損傷、老化、腫瘤的發(fā)生進(jìn)展起著重要作用，并具有潛在的治療意義，至今仍是生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。Alzheimer氏病是一種常見(jiàn)的老年病，患者在臨床上表現(xiàn)為進(jìn)行性的智力減退。細(xì)胞核固縮呈均一的致密物，進(jìn)而斷裂為大小不一的片段：③胞膜不斷出芽、脫落，細(xì)胞變成數(shù)個(gè)大小不等的由胞膜包裹的凋亡小體(apoptotic bodies)。病毒性肝炎時(shí)，嗜酸性小體形成即是細(xì)胞凋亡。當(dāng)這些因子缺乏時(shí)，會(huì)激發(fā)細(xì)胞凋亡。（2）細(xì)胞內(nèi)調(diào)控 細(xì)胞內(nèi)的某些特異蛋白與細(xì)胞死亡信號(hào)相連接，這些特異蛋白對(duì)細(xì)胞的死亡與否起決定作用。這種FasFas配體介導(dǎo)的凋亡在清除免疫反應(yīng)(如自身免疫病)中被激活的淋巴細(xì)胞非常重要。在內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶作用下，DNA進(jìn)行有控降解，產(chǎn)生長(zhǎng)度為180～200 bp整倍數(shù)的DNA片段，這正好是纏繞組蛋白多聚體的長(zhǎng)度，提示染色質(zhì)DNA恰好是在核小體與核小體連接部被切斷。4．細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別 凋亡 壞死1機(jī)制 基因調(diào)控的程序化（programmed）細(xì)胞死亡，主動(dòng)進(jìn)行（自殺性）意外事故性（accident）細(xì)胞死亡，被動(dòng)進(jìn)行（他殺性）2誘因 生理性或輕微病理性刺激因子誘導(dǎo)發(fā)生，如生長(zhǎng)因子缺乏 病理性刺激因子誘導(dǎo)發(fā)生，如缺氧、感染、中毒 死亡范圍 多為散在的單個(gè)細(xì)胞 多為聚集的大片細(xì)胞3形態(tài)特征 細(xì)胞固縮，核染色質(zhì)邊集，細(xì)胞膜及各細(xì)胞器膜完整，膜可發(fā)泡成芽，形成凋亡小體 細(xì)胞腫脹，核染色質(zhì)絮狀或邊集，細(xì)胞膜及各細(xì)胞器膜溶解破壞，溶酶體酶釋放，細(xì)胞自溶4生化特征 耗能的主動(dòng)過(guò)程，有新蛋白合成，DNA早期規(guī)律降解為180200bp片段，瓊脂凝膠電泳呈特征性梯帶狀 不耗能的被動(dòng)過(guò)程，無(wú)新蛋白合成，DNA降解不規(guī)律，片段大小不一，瓊脂凝膠電泳不呈梯帶狀5周?chē)磻?yīng) 不引起周?chē)M織炎癥反應(yīng)和修復(fù)再生，但凋亡小體可被鄰近細(xì)胞吞噬 引起周?chē)M織炎癥反應(yīng)和修復(fù)再生細(xì)胞自噬細(xì)胞自噬的生理功能1及時(shí)清除細(xì)胞中隨時(shí)產(chǎn)生的“垃圾”（如破損或衰老的細(xì)胞器、長(zhǎng)壽命蛋白質(zhì)、合成錯(cuò)誤或折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)等），保持一種基礎(chǔ)、低水平的自噬活性是至關(guān)重要的，自噬的產(chǎn)物，如氨基酸、脂肪酸等小分子物質(zhì)，細(xì)胞自噬就是一個(gè)“備用倉(cāng)庫(kù)”.鑒于上述作用，在正常生理情況下，：（1）首先，腫瘤細(xì)胞本身就具有高代謝的特點(diǎn)，對(duì)營(yíng)養(yǎng)和能量的需求比正常細(xì)胞更高，但腫瘤微環(huán)境往往不能如意，如腫瘤發(fā)生初始期到血管發(fā)生之前、腫瘤長(zhǎng)大發(fā)生血管崩塌時(shí)、腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶游走時(shí)等都會(huì)出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)不足或供應(yīng)中斷，而此時(shí)提高自噬活性可以有助于度過(guò)這一危機(jī)（2）（2）當(dāng)化療、放療后，腫瘤細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量的破損細(xì)胞器、損壞的蛋白質(zhì)等有害成分，此時(shí)提高自噬活性可及時(shí)清除這些有害物質(zhì)，并提供應(yīng)急的底物和能量為修復(fù)受損DNA贏得時(shí)間和條件.(3)另外，抑制細(xì)胞自噬可以導(dǎo)致細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡，然而，細(xì)胞自噬在腫瘤的生成和癌癥的發(fā)展中到底扮演怎樣的角色，可能產(chǎn)生于以下幾種機(jī)制(1)細(xì)胞自噬的抑制會(huì)加重壞死細(xì)胞的局部炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致腫瘤的生長(zhǎng)(2)而細(xì)胞自噬可以清除壞死的細(xì)胞器，調(diào)整內(nèi)源性的壓力，從而穩(wěn)定基因組,減少細(xì)胞向癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)變.(3)細(xì)胞自噬既可以加強(qiáng)細(xì)胞檢驗(yàn)點(diǎn)的檢查作用，又起到了穩(wěn)定基因組的作用，從而減少了細(xì)胞的癌變第三篇：生物細(xì)胞凋亡總結(jié)課程報(bào)告都在說(shuō)二十一世紀(jì)是生命科學(xué)的世紀(jì)，很榮幸能夠進(jìn)入生物科學(xué)這個(gè)行業(yè)。它主要包括發(fā)酵技術(shù)和現(xiàn)代生物技術(shù)。對(duì)我自己而言，我想在生物技術(shù)這方面有所建樹(shù)，最主要的還是在科研方面能攻克一些難題，雖然可能現(xiàn)在想法不是太成熟但是我相信經(jīng)過(guò)幾年的磨練與努力我能夠攻破這些難題。但是我們都知道越巨大的事物邁步子很大也很緩慢，何況在人才流失的情況下。我自己有一個(gè)不成熟的想法，很久之前曾了解到俄羅斯的“永生計(jì)劃”它的設(shè)計(jì)活體意識(shí)轉(zhuǎn)移到機(jī)器人身上，對(duì)此幾乎大多數(shù)人是不看好，不支持的。至于疑惑這個(gè)方面就是在教材更新?lián)Q代不及時(shí)的情況下，我們是否只能
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