【正文】 fⅠ 酶切 多態(tài)性 ，而在馬頭山羊樣本中則無多態(tài)性。 關鍵詞 ： 山羊 ； 繁殖性狀 ； 褪黑激素受體 ； PCR— RFLP 華中農業(yè)大學本科畢業(yè)論文（或設計） 5 HinfⅠ RFLP of Melatonin receptor 1 A（ MTNR1A） gene and the association with the litter size traits in goat Abstract In the present study， Melatonin receptor 1 A gene （ MTNR1A） was analysed to find the assocation with litter size in goat as a candidate gene. HinfⅠ RFLP （ Restriction Fragment Length polymorphism， RFLP） of MTNR1A was found in 65 Boer goats and 51 goats Ma Tou. No polymorphism was detected in Ma Tau goats . Two genotypes AA， GG were found in Boer goats. The frequency of AA genotype was higher than GG genotype， which were and ， respectively. The allele frequencies for A and G were and . The results of traits association analysis showed that individuals with AA genotype had additional average litter size at first kidding in Boer Goat. The additive effect value was ， while the dominant effects value . Moreover， AA genotype had additional average litter size for multiparity， the additive and dominant effects value were and ， respectively. Allele A was possiblely positively correlated with litter size in Boer goats. The additive effect was dominant at the site. Key words: Goat； Reproductive traits； MTNR1A； PCRRFLP 華中農業(yè)大學本科畢業(yè)論文（或設計） 6 前 言 褪黑激素主要是由松果體合成的 ， 其它合成部位還有 :視網膜、眼眶腔的副淚腺、唾液腺、腸的嗜鉻細胞及紅細胞 ， 松果體把對外界光照形成的神經信息經下丘腦視交叉上核轉變成體液信息 — MEL。多項研究結果表明，褪黑激素雖然對牛、鼠類、禽等動物和人的生殖系統(tǒng)的發(fā)育有抑制作用，但是對綿羊、山羊、鹿等動物則明顯表現出促進作用。 3．褪黑激素受體分子標記在其它動物中的研究進展 目前國內外對綿羊 M TNR1A 基因已經有所研究已經很多了。在綿羊中的研究結果表明，該基因對綿羊繁殖性能存在影響。 材料 試驗動物 馬頭山羊 51 頭，采自湖北省十堰市；波爾山羊 65 頭，采自湖北省宜都市波爾山羊種羊場。 華中農業(yè)大學本科畢業(yè)論文（或設計） 8 主要儀器設備 表 1 主要儀器設備 Table 1 Laboratory equipment and instruments 儀器設備名稱 型號 生產廠家 電熱恒溫水浴鍋 GD120 英國 Grant 公司 臺式離心機 TGL16G 上海安亭科學儀器廠 梯度 PCR 儀 T1 Thermo cyler 德國 Biometra 公司 冷凍離心機 Centrfuge 5810 德國 eppendorf 公司 恒溫搖床 HS80 中國科學院武漢科學儀器廠 自動雙重純水蒸餾器 SZ93 上海亞榮生化儀器廠 紫外分析儀 UVIV 北京市新科技應用研究所 電泳槽 DYYIII 北京六一儀器廠 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳議 DYY2 北京六一儀器廠 手提式高壓滅菌鍋 YXQSG46280A 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠 超純水儀 WaterPro 美國 LABCONCO 公司 移液器 1ml； 200μl ； 40μl ； 10μl ； 芬蘭 Labsystems 公司 主要試劑的配置 1) 1M ： 稱取 Tris堿溶于 800ml雙蒸水中，加濃鹽酸調至pH=，定容到 1000ml。高壓滅菌，室溫保存 ； 4) 抗凝劑（ ） ： 量取 200ml EDTA加入雙蒸水定容至 500ml。cl （ pH＝ ） ， 1mM EDTA（ pH＝ ） 。 引物 參考滑國華等（ 20xx）進行設計，序列如下： 上游引物 : 5’ ACGACCCGAGGATCTATTCC 3’ 下游引物 : 5’ ATATAAGTCCTGGGGCTTCAGATT 3’， 在下游引物中引入錯配堿基 A，當突變位點為 G（即反義鏈為 C）時，可形成 HinfⅠ（ GATTC）酶切位點；當突變位點為 A（即反義鏈為 T）時，該酶切位點缺失，由此可進行基因型判定。 PCR 反應程序 （表 3） 表 3 PCR 反應程序 Table 3 PCR amplification of the response term 步驟 steps PCR 反應條件 PCR reaction conditions 溫度 temperature 時間 time 1 預變性 95℃ 5min 2C 變性 95℃ 30sec 3C 退火 60℃ 30sec 4C 延伸 72℃ 30sec 5 延 伸 72℃ 7min 6 保溫 16℃ 10min 第二步至第四步循環(huán) 35 次。將模放于水平臺上。用吸頭吸去表面小泡。點樣時，加樣頭尖端插入上樣孔內 1/3 高度，輕輕將樣品推入，避免刺入前后凝膠和刺穿凝膠底部。20～ 30min 后檢查。 1. 拆下 電泳裝置，剝下聚丙烯酰胺凝膠，放到一個塑料盤內，用雙蒸水沖漂洗2次； 2. 加入 500ml 10％乙醇固定液，在搖床上固定 8～ 10 min，棄去反應液； 3. 加入 500ml 1％ HNO3 氧化，在搖床上輕搖 8～ 10 min，棄去反應液，用雙蒸水漂洗 2 次； 4. 倒入 500ml ％ AgNO3 銀染液，染色 15～ 30 min，棄去反應液，用雙蒸水漂洗 2次； 5. 加入 500ml 3％ Na2CO3顯色液，手搖顯色至出現清晰的銀染帶，迅速棄去反應液； 6. 用 500ml 3％ HAC 停止顯色； 7. 將已經染好的聚丙烯酰胺凝膠置于透射白光板 上，觀察酶切反應結果、記錄并拍照。 在 197 bp 的擴增片段在 118bp 處存在另一 HinfⅠ酶切位點 ， 酶切后產生 118 bp 和 79bp 片段 ， 其中波爾山羊在 11