【正文】 何介導(dǎo)表觀遺傳學(xué)酶機(jī)器PRC2的募集和表觀遺傳標(biāo)記的建立，以及這些互作對(duì)基因表達(dá)和細(xì)胞命運(yùn)的影響。對(duì)以上體外、體內(nèi)不同分化模型及小鼠早期胚胎發(fā)育，利用單、多細(xì)胞microRNA和轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)（singlecell RNAseq），全面分析多能干細(xì)胞在體內(nèi)、外定向分化過(guò)程中全基因組水平的蛋白編碼基因、ncRNA和microRNA的表達(dá)。我們將用一種新的手段，利用生物素（biotin）和FLAG雙標(biāo)計(jì)內(nèi)、外源的PRC2, 來(lái)對(duì)PRC2復(fù)合物進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)（tandem protein plex purification coupled with mass spec microsequencing）、基因組學(xué) (RNAseq、ChIPseq和RIPseq)、分子及細(xì)胞、生物化學(xué)的分析。依據(jù)體內(nèi)組織器官發(fā)生的規(guī)律，我們將誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為神經(jīng)、心血管和生殖細(xì)胞，通過(guò)組織特異性熒光蛋白報(bào)告細(xì)胞系及表面抗原，分離純化各分化階段的神經(jīng)、心血管和生殖細(xì)胞，初步建立一個(gè)穩(wěn)定的高效誘導(dǎo)分化方案，為研究分子機(jī)制提供細(xì)胞基礎(chǔ)。不僅要找到更多控制細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵因子，包括轉(zhuǎn)錄因子、microRNA、ncRNA和表觀遺傳因子, 并且全面綜合地認(rèn)識(shí)它們?nèi)绾巫饔糜诒碛^遺傳學(xué)修飾機(jī)制，影響轉(zhuǎn)錄表達(dá)，最終決定細(xì)胞譜系及功能。圖總體學(xué)術(shù)思路我們將對(duì)多能干細(xì)胞分化成的三種模式細(xì)胞譜系進(jìn)行研究，包括神經(jīng)外胚層和心血管中胚層在內(nèi)的兩類體細(xì)胞以及生殖細(xì)胞。（６）找到影響干細(xì)胞分化和命運(yùn)決定的若干關(guān)鍵調(diào)控因子（蛋白、microRNA或長(zhǎng)鏈ncRNA)；實(shí)現(xiàn)向多巴胺能神經(jīng)元、脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、心肌、血管等組織和生殖細(xì)胞的高效定向分化。（２）構(gòu)建若干基因敲入（knockin) 和報(bào)告基因的小鼠模型，為研究在動(dòng)物體內(nèi)表觀遺傳機(jī)制對(duì)胚胎發(fā)育、器官形成的調(diào)控提供實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。在多細(xì)胞或單細(xì)胞水平上，解析多能干細(xì)胞向三種不同模式細(xì)胞分化的、細(xì)胞特有的調(diào)控因子與表觀遺傳因子間相互作用的圖譜，解析全基因組表達(dá)譜和表觀遺傳修飾譜，構(gòu)建以調(diào)控因子與表觀遺傳因子的互作為中心的、關(guān)聯(lián)表觀遺傳修飾和基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，找到控制不同分化方向的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的共通點(diǎn)和特異性，全面系統(tǒng)地認(rèn)識(shí)表觀遺傳調(diào)控對(duì)多能干細(xì)胞在體內(nèi)、外及不同譜系分化、發(fā)育中的作用。利用報(bào)告基因、基因敲入和敲除的小鼠模型，研究表觀遺傳調(diào)控在體內(nèi)組織發(fā)育中的作用。在以上不同的分化過(guò)程中，構(gòu)建以表觀遺傳因子為中心的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，解析單細(xì)胞及多細(xì)胞的全基因組表達(dá)譜和表觀遺傳修飾譜，研究信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄因子、非編碼RNA和表觀遺傳因子之間的相互作用，以及這些互作對(duì)基因表達(dá)和細(xì)胞命運(yùn)的影響。那么，同組織類型的細(xì)胞在體外分化和體內(nèi)個(gè)體發(fā)育過(guò)程中的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有何異同？雖然小鼠是研究干細(xì)胞分化和哺乳動(dòng)物發(fā)育極佳的模式動(dòng)物，但是干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用需要對(duì)人類的組織細(xì)胞分化有很好的認(rèn)識(shí)。本項(xiàng)目要探索的最終科學(xué)問(wèn)題是：表觀遺傳機(jī)理如何控制多能干細(xì)胞的定向分化？表觀遺傳機(jī)制逐步限制細(xì)胞分化和發(fā)育的潛能。項(xiàng)目名稱：多能干細(xì)胞定向分化的表觀遺傳學(xué)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)首席科學(xué)家：沈曉驊 清華大學(xué)起止年限：依托部門：教育部一、關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題及研究?jī)?nèi)容１、擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題干細(xì)胞分化和個(gè)體發(fā)育伴隨著表觀遺傳狀態(tài)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)的改變。多能性干細(xì)胞在分化過(guò)程中必須經(jīng)歷一系列表觀遺傳狀態(tài)的改變和中間狀態(tài)直至譜系確立。那么，從進(jìn)化角度來(lái)看，表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在人和小鼠等物種間有何異同性？如何指導(dǎo)人類多能干細(xì)胞在體外高效定向分化為近似于體內(nèi)發(fā)育的各種功能細(xì)胞，并促進(jìn)它們的功能成熟及提高修復(fù)損傷器官的能力？尋找這些關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題的答案，將加深對(duì)干細(xì)胞定向分化和生命個(gè)體發(fā)育調(diào)控規(guī)律的認(rèn)識(shí)，為建立能應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)的定向分化技術(shù)體系奠定基礎(chǔ)。這些以表觀遺傳因子為中心的蛋白R(shí)NADNA相互關(guān)聯(lián)的機(jī)制及其對(duì)全基因組轉(zhuǎn)錄譜的影響作用，我們通稱之為表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)從分化組織細(xì)胞類型、動(dòng)物體內(nèi)外和物種進(jìn)化三個(gè)維度上比較表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的異同，鑒定出影響多能干細(xì)胞定向分化的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制和調(diào)控分子。篩選調(diào)控上述分化過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控因子（包括表觀遺傳因子、非編碼RNA、轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)分子）；通過(guò)綜合調(diào)控若干關(guān)鍵因子來(lái)優(yōu)化各分化體系，為人工操控干細(xì)胞命運(yùn)，建立高效、安全的定向分化手段提供線索，為干細(xì)胞療法的臨床實(shí)現(xiàn)提供理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。（３）繪制并比較體內(nèi)外各模式細(xì)胞的全基因組表達(dá)圖譜（包括蛋白編碼基因、microRNA和長(zhǎng)鏈ncRNA）和表觀遺傳修飾圖譜。 （７）預(yù)期在國(guó)際主流期刊上（影響因子IF5）發(fā)表論文30～50篇，力爭(zhēng)在國(guó)際頂尖學(xué)術(shù)期刊上（包括Cell、Nature和Science等）發(fā)表論文 3～6篇。利用并優(yōu)化現(xiàn)有的分化手段來(lái)建立分化的模式細(xì)胞系，研究和比較它們?cè)谖捶只胺只癄顟B(tài)下的信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和染色質(zhì)水平上的調(diào)控，建立以表觀遺傳調(diào)控為中心的涉及蛋白、DNA和RNA 相互作用及轉(zhuǎn)錄表達(dá)的四維調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（通稱為表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)）。通過(guò)比較人與小鼠同類細(xì)胞分化過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制的異同, 從進(jìn)化的角度理解這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的演變。PRC2主導(dǎo)的H3K27的三甲基化（H3K27me3）代表一類重要的表觀遺傳抑制機(jī)制。我們首先利用人和小鼠ESCs的分化模型，研究PRC2在神經(jīng)、心血管和生殖系統(tǒng)中如何與蛋白、RNA和DNA結(jié)合和相互作用。利用ChIPSeq技術(shù)分析重要表觀遺傳修飾譜（包括H3K27me3）。構(gòu)建在不同分化系統(tǒng)和體內(nèi)、外發(fā)育模型的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)比較這些網(wǎng)絡(luò)，認(rèn)識(shí)它們的共通點(diǎn)和特異性，尋找影響定向分化的網(wǎng)絡(luò)中心或節(jié)點(diǎn)，篩選出更多的控制細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵因子，包括信號(hào)因子、轉(zhuǎn)錄因子、microRNA、ncRNA和表觀遺傳因子。最后，我們將把研究成果轉(zhuǎn)化到人類ESCs定向分化的體系中, 優(yōu)化培養(yǎng)條件，利用mRNA 轉(zhuǎn)染、化學(xué)小分子誘導(dǎo)等先進(jìn)技術(shù)，爭(zhēng)取最大限度地提高人類多能干細(xì)胞向各種神經(jīng)、心血管和生殖組織定向分化的效率和安全性，并通過(guò)動(dòng)物移植模型驗(yàn)證分化細(xì)胞的功能。圖各課題間相互關(guān)系課題１、２將建立和優(yōu)化多能干細(xì)胞向三類組織細(xì)胞分化的培養(yǎng)體系（圖2）。并且, 課題３、４的研究?jī)?nèi)容應(yīng)該是表觀遺傳調(diào)控路線中的上下游的關(guān)系。通過(guò)對(duì)不同分化系統(tǒng)的比較，我們才能更好地認(rèn)識(shí)調(diào)控