【正文】 抗原蛋白為低免疫原性抗原的免疫，也可用于大動(dòng)物免疫如兔、豬等。通過這兩種免疫方法制備的單克隆抗體均能被 DNA 編碼的蛋白識(shí)別。由皮膚和肌肉途徑給予 DNA 均可產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答。②機(jī)體對(duì)抗原的遞呈及相應(yīng)的反應(yīng)性。核糖體展示技術(shù)已經(jīng)成功地用于生產(chǎn)抗黃體酮的抗體片段。3． 核糖體展示技術(shù) 核糖體展示技術(shù)是一種完全在體外合成并篩選蛋白質(zhì)的無細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)。當(dāng)抗體分離出來時(shí),噬菌體系統(tǒng)同時(shí)也提供了設(shè)計(jì)抗體親和性及其應(yīng)用的模式。 制備方法抗體的具體制備方法是將抗原包被在固定介質(zhì)上,加入待篩選的噬菌體顆粒與固定的抗原結(jié)合,獲取結(jié)合的抗體,將未結(jié)合的抗體洗脫,從噬菌體庫中篩選出針對(duì)特定抗原的特異性抗體的可變區(qū)。表面重塑抗體是對(duì)鼠抗體框架區(qū)表面氨基酸的殘基進(jìn)行重塑或替換，該技術(shù)僅改造或替換與人抗體有明顯差異的表面氨基酸的殘基。 技術(shù)原理抗體上，并不是整個(gè) CDR 都參與抗原的特異性識(shí)別，在 CDR 區(qū)中僅一部分氨基酸殘基與抗原結(jié)合，這些氨基酸殘基決定抗體的特異性，被稱之 SDR。 技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)嵌合抗體不但具有與鼠源單抗相同的特異性、親和力和產(chǎn)量,而且可根據(jù)不同的需要接上不同亞類的人恒定區(qū)基因來改變抗體的功能,使用更加靈活。中國行業(yè)研究網(wǎng)發(fā)布的《20222022 年中國單克隆抗體行業(yè)投資分析及深度研究咨詢報(bào)告》顯示：未來，全球單克隆抗體藥依舊會(huì)保持較高的增長(zhǎng)率。全球范圍內(nèi)單抗藥產(chǎn)業(yè)的布局是不平衡的，其中歐美研發(fā)實(shí)力最強(qiáng)，產(chǎn)品線豐富，而屬于新生力量的中國正大力發(fā)展單抗藥物，努力提供單抗藥物產(chǎn)品線。因此,在保持對(duì)特異抗原表位的高親和力的基礎(chǔ)上人源化和全人化的改造,減少異源抗體的免疫原性成為單抗研究的重點(diǎn)。近年來，隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了嵌合抗體制備技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)等，這些技術(shù)有效地解決了單克隆抗體鼠源性等問題，還有 DNA 免疫制備抗體的研究進(jìn)展，使單克隆抗體憑借自身高度特異性和均一性的特點(diǎn)在治療腫瘤、自身免疫性疾病和器官移植等方面顯出了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和良好的應(yīng)用前景，故單克隆抗體制備技術(shù)的發(fā)展也就顯得尤為重要。專業(yè)課程論文題 目: 單克隆抗體綜述及其行業(yè)發(fā)展動(dòng)態(tài)分析 姓 名:學(xué) 院: 食品科技學(xué)院 專 業(yè): 生物工程 班 級(jí):學(xué) 號(hào):指 導(dǎo)教師:單克隆抗體綜述及其行業(yè)發(fā)展動(dòng)態(tài)分析摘要：?jiǎn)慰寺】贵w技術(shù)是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的重要工具，它可用于分析抗原的細(xì)微結(jié)構(gòu)及檢驗(yàn)抗原抗體未知的結(jié)構(gòu)關(guān)系。1975 年,Kohler 和 Milstein 創(chuàng)立了雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體( monoclonal antibody，McAb) ，所謂 McAb 是利用 HAT 培養(yǎng)基篩選出既能穩(wěn)定生長(zhǎng)又能產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體是由識(shí)別一種抗原決定簇的細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的具有高度特異性和均一性的抗體，故稱之為 McAb。此外,傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)還存在制備周期較長(zhǎng),成本較高,雜交瘤細(xì)胞不穩(wěn)定抗性會(huì)丟失等缺陷。此外，前景廣闊的單抗藥物受到藥企的青睞，很多跨國藥企通過收購技術(shù)平臺(tái)涉足這一領(lǐng)域，羅氏是這個(gè)領(lǐng)域內(nèi)典型的例子，其收購的基因泰克公司是單抗藥物行業(yè)的全球領(lǐng)跑者。到 2022 年，全球單克隆抗體藥銷售額有望達(dá) 980億美元左右。然而，盡管盡力降低鼠源成分，這實(shí)現(xiàn)了抗體的高度人源化,但仍可誘發(fā)排異反應(yīng),并未完全解決鼠抗體的免疫原性問題,而且人源化過程繁復(fù)且費(fèi)用昂貴,大量的反復(fù)試驗(yàn)不可避免。SDR 移植抗體僅將異源抗體 CDR 區(qū)內(nèi)與抗原結(jié)合關(guān)系密切的 SDR，移植到人抗體相應(yīng)位置上，使人源化抗體的免疫原性進(jìn)一步降低。在維持抗體活性和減少異源性基礎(chǔ)上選用與人抗體表面殘基相似的氨基酸殘基替換，使抗體與抗原結(jié)合具有更好的親和力和特異性。用表達(dá)有相應(yīng)抗體分子的噬菌體顆粒去感染宿主菌,使該噬菌體顆粒得到擴(kuò)增。 技術(shù)缺點(diǎn)但是該技術(shù)也存在一定的缺陷,由于受表達(dá)系統(tǒng)的限制,抗體庫的庫容不足以支持獲得稀有的抗體,難以涵蓋一些動(dòng)物抗體的多樣性。 技術(shù)原理該技術(shù)建立不受細(xì)胞轉(zhuǎn)染和表達(dá)等因素影響的完全體外展示系統(tǒng)，利用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增含目的基因的 cDNA 文庫，同時(shí)引入啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)及莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在轉(zhuǎn)錄/翻譯耦聯(lián)系統(tǒng)作用下，形成“蛋白質(zhì)核糖體mRNA”三元復(fù)合物，構(gòu)成核糖體展示的抗體庫，再用相應(yīng)的抗原對(duì)翻譯混合物進(jìn)行篩選并從中分離 mRNA，通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)富集目的基因，并將目的基因?qū)氡磉_(dá)載體，從而獲得庫容量大、特異性強(qiáng)、親和力高的人源基因工程抗體庫。4 DNA 免疫制備抗體技術(shù)DNA 免疫是近年發(fā)展起來的一種新型抗體制備法。在抗原的免疫原性無法改變的情況下，可提高機(jī)體對(duì)相應(yīng)抗原的反應(yīng)性。 具體方法一般選用 5 一 8 周齡的 BALB/C 雌性小鼠，免疫 6 周齡以下小鼠可獲得更好的免疫應(yīng)答，免疫 4 周齡小鼠特異性蛋白質(zhì)表達(dá)水平最高。還有人發(fā)現(xiàn)肌肉注射 DNA 的特異性蛋白質(zhì)表達(dá)效率明顯高于靜脈注射 DNA，經(jīng)皮內(nèi)注射和肌肉注射等量 DNA，發(fā)現(xiàn)肌肉免疫的方法產(chǎn)生特異性抗體和 CTL 的效率高，因而肌肉注射方法最佳。為特異性強(qiáng)、純度高的單克隆抗體的制備提供了一個(gè)省時(shí)省力的好方法。 技術(shù)應(yīng)用前景隨著 DNA 免疫技術(shù)的發(fā)展，能免疫除多糖類抗原外所有已知 DNA 編碼的蛋白質(zhì)抗原，如病毒蛋白、免疫球蛋白、腫瘤抗原等閉。與上年相比，城市居民惡性腫瘤、腦血管病死亡比例略有上升。癌癥每年給中國造成的經(jīng)濟(jì)損失逾千億元?？偟脕砜矗瑖鴥?nèi)抗腫瘤藥醫(yī)院用藥格局有向國外看齊的趨勢(shì)，突出表現(xiàn)在小分子激酶抑制劑、單抗和內(nèi)分泌類抗癌藥的份額穩(wěn)步擴(kuò)大。但正因?yàn)閮r(jià)格高，所以可在短時(shí)間內(nèi)使用藥額大幅提高。這種選擇性殺傷作用是單抗藥物用于腫瘤治療的重要基礎(chǔ)。單抗藥物具有更高的療效　由抗人體腫瘤的單抗與藥物構(gòu)成的偶聯(lián)物對(duì)移植于裸鼠的相應(yīng)人體腫瘤生長(zhǎng)有抑制作用。來源于植物或細(xì)菌的毒素，由于有強(qiáng)烈毒性，很難作為治療劑使用；但毒素(或單鏈毒素)與單抗的偶聯(lián)物可在動(dòng)物模型顯示療效。確定單抗或單抗偶聯(lián)物在體內(nèi)具有靶向性，為進(jìn)一步闡明其療效提供了依據(jù)。表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(EGFr)在人鱗癌、乳腺癌和腦膠質(zhì)瘤等均有較高的表達(dá)?？罐D(zhuǎn)鐵蛋白受體單抗構(gòu)成的免疫毒素對(duì)腦瘤細(xì)胞有高度細(xì)胞毒性；高度惡性的腫瘤對(duì)免疫毒素的敏感性更高。近年來，以血管內(nèi)皮細(xì)胞為靶點(diǎn)的單抗藥物受到廣泛關(guān)注。據(jù)報(bào)道，抗 VEGF 的中和性單抗具有廣譜的抗腫瘤作用，對(duì)移植于裸鼠的人體癌瘤有顯著療效。說明單抗藥物有可能用于克服腫瘤細(xì)胞抗藥性。 Ig 根據(jù)其重鏈穩(wěn)定區(qū)的分子結(jié)構(gòu)和抗原特異性的不同，分為五類：類別與重鏈對(duì)應(yīng)關(guān)系如下分類： IgG、IgA、IgM、IgD、IgE，重鏈： γ、 α、 μ、 δ、 ε：κ、λ 型根據(jù)氨基酸排列順序的不同分為可變區(qū)（V）和恒定區(qū)（C） 。鉸鏈區(qū) 位于 CH1 與 CH2 之間，含有豐富的脯氨酸，因此易伸展彎曲，而且易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解。IgM、IgE 分 功能區(qū)的作用：①VH 和 VL 是結(jié)合抗原的部位；②CH 和 CL 上具有部分同種異型的遺傳志；③IgG 的 CH2 和 IgM 的 CH3 具有補(bǔ)體 C1q 結(jié)合位點(diǎn)，可啟動(dòng)補(bǔ)體活化經(jīng)典途徑；④IgG 可通過胎盤；⑤IgG 的 CH3 可結(jié)合細(xì)胞表面的 FcR；IgE 的 CH2 和 CH3 可與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的 IgE Fc 受體結(jié)合。對(duì)分泌型 IgA 具有保護(hù)作用圖表 8 IGM 和分泌型 IGA 的結(jié)構(gòu)示意圖　　圖表 9 人分泌型 IGA 和 IGM 的局部產(chǎn)生示意圖免疫球蛋白的功能（一）V 區(qū)的功能：主要功能是識(shí)別和特異性的結(jié)合抗原.Ig 單體可結(jié)合兩個(gè)抗原表位，為雙價(jià) Ab +Ag——發(fā)揮免疫效應(yīng)B 細(xì)胞膜表面的 IgM 和 IgD 是 B 細(xì)胞識(shí)別抗原的受體（二）C 區(qū)的功能： IgM，IgG1~3 + Ag 經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體、IgE 的凝聚物可經(jīng)旁路途徑激活補(bǔ)體 Fc 受體 （細(xì)胞親嗜性） ：顆粒性抗原IgG 促吞噬細(xì)胞的吞噬5. ADCC 作用：腫瘤細(xì)胞等與 IgG 結(jié)合,與 細(xì)胞 Fc 受體結(jié)合,增強(qiáng)其對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用 I 型超敏反應(yīng)：IgE 穿過胎盤和黏膜圖表 10 免疫球蛋白的功能示意圖圖表 11 抗體的調(diào)理吞噬作用示意圖圖表 12 I 型超敏反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制示意圖圖表 13 抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞作用　在近 20 年深入研究和臨床試驗(yàn)之后,單抗用于治療癌癥逐漸受到重視,并從臨床試用階段轉(zhuǎn)變?yōu)槊绹?FDA 批準(zhǔn)的商品。美羅華是利用重組 DNA 技術(shù)將鼠源免疫球蛋白( Ig) 的可變區(qū)與人免疫球蛋白 G1 恒定區(qū)結(jié)合的鼠 P 人嵌合抗體,可在中華倉鼠卵巢細(xì)胞中大量產(chǎn)生?？贵w與 CD20 受體結(jié)合可促進(jìn)凋亡。在一項(xiàng) 166 例化療后進(jìn)展的低度惡性淋巴瘤患者進(jìn)行的試驗(yàn)中,美羅華治療濾泡型淋巴瘤有效率約 60 %。血中藥物濃度持續(xù)時(shí)間與腫瘤緩解可能性有關(guān)。對(duì)如此高有效率可能的解釋是:這些患者治療開始時(shí)腫瘤負(fù)荷小,因?yàn)閷?duì)這些移植后患者觀察密切,一旦復(fù)發(fā)即得到治療,且事實(shí)上所有患者均為濾泡型淋巴瘤。這些毒性的發(fā)生機(jī)制似乎是由于美羅華與循環(huán)中 CD20 陽性 B 淋巴細(xì)胞(包括正常和惡性淋巴細(xì)胞) 發(fā)生反應(yīng)所致。另一方面,快速輸入與循環(huán)中 B 細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)的大劑量單抗可導(dǎo)致嚴(yán)重反應(yīng),包括嚴(yán)重低氧血癥、重度低血壓及死亡。h 1 。有時(shí)效果比初治時(shí)更好更持久,這可能與患者在復(fù)治時(shí)腫瘤負(fù)荷更小有關(guān)。此外,有較長(zhǎng)病史的濾泡型淋巴瘤患者即使對(duì)化療無效,也可能對(duì)美羅華有效?？贵w劑量與有效率的關(guān)系　在一項(xiàng)低度惡性淋巴瘤試驗(yàn)中, 患者接受 8 周治療, 有效率大約 60 % ,但尚不清楚是否效果更持久。美羅華對(duì)中度惡性淋巴瘤的療效　法國一項(xiàng) 54 例患者臨床試驗(yàn) [ 8 ] ,12 例套區(qū) (mantle zone) 淋巴瘤和30 例大細(xì)胞淋巴瘤,總有效率為 31 % ,中位緩解期大于 8 個(gè)月。m 2 ,每周 1 次共 8 周,另一組在第1 周給予標(biāo)準(zhǔn)劑量后,第 2～8 周給予 500mg客觀有效率高達(dá) 96 % ,其中 63 %完全緩解和 33 %部分緩解。最近的報(bào)道證實(shí)了第一種情況,即在血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)高的患者中發(fā)生了 3～4 度毒性。更好的策略是尋求將該抗體用于其他方式治療有效后的維持或鞏固治療。CHOP 和 CHOP 加美羅華的臨床隨機(jī)對(duì)比試驗(yàn)正在進(jìn)行。最近,該抗體正在用于與艾滋病相關(guān)的淋巴瘤或中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤的治療,而這兩組患者在最初的試驗(yàn)中是被排除在外的。Her22Pneu 是一個(gè) 185kd 的跨膜受體,結(jié)構(gòu)與表皮生長(zhǎng)因子(EGF) 受體高度同源。Hercep2tin 與受體結(jié)合導(dǎo)致受體內(nèi)在化,并抑制 EGF 和Neu 分化因子與受體結(jié)合。隨著劑量的提高,平均半衰期延長(zhǎng)并且清除減少,10 和 500mg 劑量水平的半衰期分別為 1. 7d 和 12d。第 1 周靜脈給予負(fù)荷量 250mg ,然后,每周 1 次靜脈注射 100mg ,共 10 周。m 2 ,d1 ,d29 和 d57 。均接受Herceptin 負(fù)荷量 4mg222 例化療失敗患者參加的是開放性非隨機(jī)試驗(yàn),其中 66 %以前接受過輔助化療,68 %因轉(zhuǎn)移至少接受過 2 種化療方案,25 %大劑量化療加自體造血干細(xì)胞解救后復(fù)發(fā)。kg 1 ,靜滴 90min ,直至腫瘤進(jìn)展。469 例以前未接受過化療的患者隨機(jī)分入化療組或不加 Herceptin 組,動(dòng)物研究提示,在抗體存在的情況下,可增加化療藥的細(xì)胞毒作用。以前輔助治療時(shí)曾用過蒽環(huán)類藥物者被隨機(jī)分為單用單抗或抗體加紫杉醇 175mg與單用化療相比,化療加 Her2ceptin 治療的患者有效率更高,且緩解期更長(zhǎng),提示在治療乳腺癌時(shí)最好是與化療聯(lián)合應(yīng)用而不是單用。假設(shè)這些細(xì)胞在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)被快速清除,而這種清除又與細(xì)胞因子的釋放有關(guān),就可以解釋這些癥狀。毒性在第 1 次輸注單抗后最明顯,在以后的治療中只要保持同樣血清單抗水平就不會(huì)發(fā)生毒性。這樣看來,Herceptin 與紫杉類聯(lián)用時(shí)比與蒽環(huán)類聯(lián)用更安全。過度表達(dá) Her22Pneu 的患者在理論上都可作為應(yīng)用 Herceptin 的臨床試驗(yàn)的入選者。1721A 可通過不同機(jī)制產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)。作為 B 細(xì)胞增殖基因型網(wǎng)絡(luò)控制中的一部分,Ab2 產(chǎn)生對(duì)抗自身的抗體, 包括與 Ab2 的基因型發(fā)生反應(yīng)的抗體(Ab3) 。研究顯示, 單次注射 15 ～ 1 000mg 是安全的, 但 50 %患者在單次注射后產(chǎn)生人抗鼠抗體。入組患者均為 Duke’sC 期行完全切除以盡可能根治的結(jié)腸癌患者。1721A 治療組死亡率減少 30 % ,腫瘤復(fù)發(fā)減少 27 %。北美的一些試驗(yàn)正在比較 5Fu + 左旋咪唑或 5Fu + CF 與 5Fu + 1721A 治療 Duke’s C 期結(jié)腸癌。本文總結(jié)了這 3 種治療性單抗在美國廣泛應(yīng)用的情況。 自 1986 年美國 FDA 首次批準(zhǔn)治療性、鼠源性單抗 OKT3 上市以來，每年進(jìn)入臨床試驗(yàn)的單抗產(chǎn)品數(shù)量從總體上看呈上升之勢(shì)。值得一提的是，國內(nèi)單抗技術(shù)研發(fā)還不成熟，國外單抗藥物都已經(jīng)是人源的，國內(nèi)還是人源化的，相當(dāng)于美國上個(gè)世紀(jì) 90 年代初的樣子。大規(guī)?？贵w生產(chǎn)成本大約為 200 美元/克，售價(jià)高達(dá) 5000 美元/克，生產(chǎn)成本只占售價(jià) 1/25。