ung酶在pcr中的作用-wenkub
2023-07-10 23:45:30 本頁面
【正文】 優(yōu)點：可以去除任何來源的污染；UNG處理可以和PCR擴增在同一個反應管內(nèi)進行；由于擴增產(chǎn)物中有大量dU存在，可徹底消除污染源。UNG處理后，引物失去了結(jié)合位點而不能擴增。2. dUTP法：用dUTP代替dTTP，使產(chǎn)物中摻入大量dU。1. 原理：在PCR產(chǎn)物或引物中用dU 代替dT。? 反應條件： 50 ℃ ，2 分鐘；反應 buffer: 20mM TrisHCl(PH:)。同時UNG酶被滅活，不會再降解新擴增的產(chǎn)物UDNA。作用：為保證PCR結(jié)果的準確性，要預防非特異性PCR擴增和污染。常用的措施是使用UNG酶(UracilNGlycosylase)和Taq酶熱啟動。高品質(zhì)的UNG酶可以消除高達108的UDNA產(chǎn)物，和熱啟動Taq酶一同用于建立含有UNG/dUTP防污染體系的熱啟動PCR反應系統(tǒng)。 1mM EDTA。這種dU化的PCR產(chǎn)物與UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N糖基鍵，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，從而失去被再擴增的能力。在再次進行PCR擴增前，用UNG處理PCR混合液即可消除PCR產(chǎn)物的殘留污染。對長片段（12kb以上）的擴增用dUTP法效率較用dTTP低，而用dU法就可克服這一缺點。5. 需注意的是摻入dUTP的DNA不應對產(chǎn)物的任何操作有影響，在進行PCR產(chǎn)物克隆時，應該轉(zhuǎn)化UNG（UNG缺陷）大腸桿菌受體菌，否則轉(zhuǎn)化產(chǎn)物會被受體菌UNG消化掉。在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠 拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題.(四)實驗室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學實驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常 ，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命 .污染的監(jiān)測一個好的實驗室，要時刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染.對照試驗：1）陽性對照:在建立PCR 反應實驗室及一般的檢驗單位都應設(shè)有PCR 陽性對照，它是PCR 反應是否成功、重復性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標本，如以重組質(zhì)粒 為陽性對照，其含量宜低不宜高(100 個拷貝以下).但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標本， 試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗人員心中有數(shù)時，在以后的實驗中可免設(shè)陽性對照.2）陰性對照:每次PCR ①標本對照:被檢的標本是血清就用鑒定后的正常血清作對照。④PCR 產(chǎn)物鑒定區(qū). 或RNA.(二)吸樣槍:，因而加樣或吸取模板核酸時要十分小心，吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染.(三)預混和分裝PCR 試劑:所有的PCR 試劑都應小量分裝，如有可能，PCR 反應液應預先配制好，然后小量分裝，20℃，PCR 試劑，PCR 反應液應與樣品及PCR 產(chǎn)物分開保存，不應放于同一冰盒或同一冰箱.(四)防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應一次性使用.(五)設(shè)立適當?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ?，陽性對照以能出現(xiàn)擴增條帶的最低量的標準病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應都應有一管不加模板的試劑對照及相應不含有被擴增核酸的樣品作陰性對照.(六)減少PCR 循環(huán)次數(shù)，只要PCR 產(chǎn)物達到檢測水平就適可而止.(七)選擇質(zhì)量好的Eppendorf 管，以避免樣本外溢及外來核酸的進入
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