【正文】 養(yǎng)基組成為：6 %葡萄糖、 %蛋白胨、 %玉米油、0. 5 %氯化氨?；贚ee Hendrickson提出的洛伐他汀生物合成路線的推測 ,醋酸鹽、琥珀酸鹽和檸檬酸鹽對洛伐他汀發(fā)酵的影響也在研究。這種良好的水的微環(huán)境有助于淀粉酶的擴散心臟淀粉水解后葡萄糖和其他鹽類的擴散，可更快地被菌體吸收利用。在固態(tài)發(fā)酵時，孢子萌發(fā)及菌絲生長都需要適宜的水分，因此控制基質(zhì)含水量是固態(tài)發(fā)酵過程中的重要環(huán)節(jié)之一。土曲霉發(fā)酵Lovastatin生產(chǎn)中最適pH 值一般在 ～ 內(nèi)，最小值出現(xiàn)在 48 h，這恰好是土曲霉中Lovastatin重要合成基因——聚酮體合成酶基因 pksM 轉(zhuǎn)錄表達的時期，這可能也是培養(yǎng)基優(yōu)化的重要參考。同時研究發(fā)現(xiàn)，單單加入 L蛋氨酸反而大大降低洛伐他汀的產(chǎn)量 ，D蛋氨酸在72 h加入會產(chǎn)生和加入蛋氨酸消旋體一樣的效果[14]。Kimura等在研究Lovastatin合成時提出：蛋氨酸是Lovastatin合成的重要前體物質(zhì)。pez 等研究進一步表明，40∶1 的 C/N 比較合適。碳氮比例的研究，氮源一般是營養(yǎng)限制性因素，直接決定了最終菌絲濃度的大小，當(dāng)?shù)礉舛认嗤瑫r，最終的菌絲濃度不會有大的差異；而碳源對菌絲濃度幾乎沒有影響，然而在氮源濃度不變的情況下，增加碳源的量，就能大幅度增加洛伐他汀的產(chǎn)量。微生物快速利用的碳源和氮源，如葡萄糖和蛋白胨等，可導(dǎo)致在發(fā)酵 24～48 h 內(nèi)菌絲不可控制的生長，從而引起發(fā)酵液黏性的上升，溶氧的迅速下降，最終使洛伐他汀的產(chǎn)量下降，但是適量的快速利用碳源和氮源也有利于菌絲的快速生長，這一點已廣泛用于種子培養(yǎng)基及發(fā)酵前期的菌絲生長。微生物在生長和代謝過程中，需要從外界不斷吸收營養(yǎng)物質(zhì)，經(jīng)過一系列生物化學(xué)作用，獲得能量并形成新的細胞物質(zhì)、代謝產(chǎn)物，同時排出副產(chǎn)物及廢物。紫外照射誘變操作簡單，經(jīng)濟實惠，一般實驗室條件都可以達到，且出現(xiàn)正突變的幾率較高，土曲霉的誘變大多采用這種方法。隨機挑單菌落接斜面，待培養(yǎng)成熟后，進搖瓶試驗，結(jié)果在Ｎ＋ 20w，%的高產(chǎn)株N28，并進行傳代產(chǎn)量穩(wěn)定性試驗，結(jié)果獲得的菌株生產(chǎn)能力波動幅度較小，類似物雜質(zhì)組分比例保持相對穩(wěn)定[7]。在膽固醇合成的五大步反應(yīng)中，第一步，羥甲基戊二酰 CoA ( HMGCoA) 的形成最關(guān)鍵，此步反應(yīng)中的HMGCoA（3羥基3甲基戊二酰輔酶A）還原酶是限速酶。如上所述，洛伐他汀是可以顯著降低血膽固醇的物質(zhì)，能降低活體內(nèi)低密度脂蛋白(LDL)的含量，同時提高高密度脂蛋白( HDL)的含量，從而有效降低血漿中膽固醇含量。1980 年Alberts等從土曲霉發(fā)酵液分離得到一個降血漿膽固醇物質(zhì)，即洛伐他汀。他汀類藥物在心腦血管疾病治療方面的應(yīng)用是一次革命性的里程碑。在我國，其死亡率僅次于惡性腫瘤，居第二位。熔點157℃159℃，易溶于甲醇、乙醇、丙醇、乙酸乙酯、氯仿及苯中，不溶于正己烷及石油醚中。在甲醇中紫外光譜顯示的最大值在2223246nm，在70％乙醇中的最大紫外吸收波長在236nm，在KBr溶液中的紅外線光譜吸收波長為355,2970,1696,1220nm[1]。缺血性心腦血管病的病理基礎(chǔ)是動脈粥樣硬化(atherosclerosis)。因為它可阻斷膽固醇合成的關(guān)鍵步驟，從而使調(diào)脂藥獲得突破性進展。隨后人們又發(fā)現(xiàn)與其結(jié)構(gòu)相似的Monacolin J、L、X、M、Dihydromevinolin 及Dihyfromonacolin L等成分[4]。研究還證明，洛伐他汀在人體內(nèi)含量只要達到 ～，膽固醇的合成就會受阻，經(jīng)弱堿加工形成的鹽類具有防治膽結(jié)石、前列腺肥大、降低腫瘤增殖率、延長壽命的效果。洛伐他汀是HMGCoA 還原酶的競爭性抑制劑，它可使 HMGCoA 還原酶活性下降，從而有效地減少或阻斷體內(nèi)膽固醇的合成[6]。因此，物理誘變劑Ｎ＋微波等離子體選育微生物具有較高的實用價植，對于篩選lovastatin的高產(chǎn)菌株也具有很大的價值。、超聲波復(fù)合誘變 ，用酶法制備原生質(zhì)體，通過紫外線和超聲波復(fù)合誘變，在超聲波500w，200min以及紫外線30w，30cm處10分鐘，紅曲色素得到提高，洛伐他汀的產(chǎn)量也大大提高[9]。在發(fā)酵培養(yǎng)基中，碳源和氮源的選擇是重中之重[11]。緩慢利用的碳源和氮源，如麥芽糊精等能更好地提高洛伐他汀的產(chǎn)量，并且有利于最佳菌球形態(tài)的形成；同樣緩慢利用的乳糖和豆餅粉也是不錯的組合。所以說洛伐他汀發(fā)酵過程中，在保證合適菌絲濃度的前提下，適當(dāng)選擇一個比較高的碳氮比例，能大幅度提高洛伐他汀的產(chǎn)量。Hassan Hajjaj 等研究發(fā)現(xiàn)，以葡萄糖和谷氨酸鹽組成培養(yǎng)基，當(dāng)葡萄糖消耗盡時，洛伐他汀才開始合成，而以乳糖為培養(yǎng)基碳源時，乳糖幾乎沒有消耗，洛伐他汀就已經(jīng)開始合成。而且在Lovastatin合成過程中有甲基化一步，蛋氨酸可能參與了甲基化，所以適量加入蛋氨酸可以提高Lovastatin的產(chǎn)量。 pH值pH值是影響微生物生長的重要參數(shù)，對微生物生長、代謝和產(chǎn)物的形成都有很大影響，pH的變化是菌體代謝變化的綜合反應(yīng)，從它的變化中可以推測出菌體生長代謝及抗生素合成的基本狀態(tài)。溫度是微生物發(fā)酵的一個重要參數(shù)，因此溫度的確定非常重要。實驗中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)含水量較少時，菌體生長情況很差，發(fā)酵液中Lovastatin的含量也很低；含水量增加到40％時，發(fā)酵的第 2天菌體長勢良好，由于有較多的熱量產(chǎn)生，2天后物料開始結(jié)塊，底部有紅色粘稠液體產(chǎn)生；而含水量較多時，物料也出現(xiàn)結(jié)塊，卻不再產(chǎn)生游離水，物料發(fā)酵較透，干物質(zhì)的得率明顯低于含水量的20％時。當(dāng)含水量較多時，滅菌時會使基質(zhì)變得粘稠，孔隙小，在培養(yǎng)過程中通氣性變差，使Lovastatin的產(chǎn)量降低。在pacin發(fā)酵中已有報告，琥珀酸鹽和檸檬酸鹽的添加的確能提高發(fā)酵產(chǎn)量，醋酸鹽則抑制其發(fā)酵產(chǎn)量[18]。 經(jīng) 28 ℃需氧培養(yǎng)10d，所得發(fā)酵液經(jīng)處理可得到無色的洛伐他汀晶體。1995 年北京市藥品檢驗所的張小茜、周富榮及北大維信生物科技有限公司的石濟民測定了降血脂藥物血脂康中的洛伐他汀含量并初步確定了測定條件。對于提取時間，用75 %乙醇為溶劑，分別以不同時間進行超聲處理，發(fā)現(xiàn)處理20 min 提取較完全。 %（n=3），精密度Sr (相對標(biāo)準偏差) = % ( n = 5)，重現(xiàn)性Sr= 1163 % ( n = 5)，樣品回收率在 98/04 %～ %之間( n = 6) 。該方法線性關(guān)系良好r = 019998。由于該流動相在紫外區(qū)無吸收，所以極易用歸一法測定各雜質(zhì)含量[21] 。該方法的線性范圍為 5～500 g/L，最低檢測濃度為 5μg/L，10，100，500μg/L 3 種濃度的平均回收率為( 177。薄層掃描法是較早的一種測定方法，主要是采用雙波長薄層進行掃描測定樣品中的洛伐他汀含量。雖然檢測精度和檢測下限沒有 HPLC 法好，但是它操作簡單、快速，成本也比較低。2001 年文鏡等建立了對酸式洛伐他汀測定的雙波長紫外法。 ( n = 8，變異系數(shù)為 %)，在 ～10 mg/L 范圍內(nèi)洛伐他汀(酸式) 與吸光度有良好的線性關(guān)系， mg/L 。他們用 pH ，并在30 ℃，200 r/min 震振器中震振1 h。1998 年韓國的 ChoiHyeJin 等用 HPLC 法測定了人血中和尿中的洛伐他汀。1989 年，WangIversonDavid 等就用氣相色譜聯(lián)用質(zhì)譜對人血清中酸式洛伐他汀進行了測定?！?，回收率為 %。 現(xiàn)在比較常用的方法有：HPLC 法(包括聯(lián)接各種檢測器，如紫外檢測器及電化學(xué)檢測器等)、紫外分光光度法，熒光光度法、氣相色譜法及薄層層析法等。紫外分光光度法對樣品測定有簡便、準確、快捷、經(jīng)濟的優(yōu)點，但紅曲或其他發(fā)酵品中成分復(fù)雜，用紫外分光光度法必需要對樣品進行預(yù)處理，否則只能測出Monacolin 類化合物的總量。隨著分析儀器的推陳出新，今后洛伐他汀的檢測方法必將繼續(xù)朝著快速、靈敏、簡便、可靠的方向發(fā)展，并且一定會涌現(xiàn)出更加完善的檢測方法[31]。高嘉安等[33]從收集到的42株紅曲菌中發(fā)現(xiàn)有16株含有l(wèi)ovastatin，分屬M．purpureus、M．ruber、M．rubigerus、M．pilosus和M．vitreus。1996 年我國由四川抗生素研究所開發(fā)的洛伐他汀搶仿成功并逐漸實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，首次獲準生產(chǎn)洛伐他汀原料藥、片劑；1997年首次獲準生產(chǎn)洛伐他汀膠囊。國內(nèi)的報道以制劑研究居多，黑龍江肇東華富藥業(yè)有限責(zé)任公司以洛伐他汀為主藥，選用新型輔料，進行洛伐他汀膠囊的生產(chǎn)。使血脂康一“出世”，就具有有效成分明確、療效顯著、主要作用機理明確、產(chǎn)品有嚴格質(zhì)控標(biāo)準、質(zhì)量穩(wěn)定、制劑工藝先進等鮮明特色。我國出口洛伐他汀無論在質(zhì)量或報價上均比其他國家稍占優(yōu)勢。由于普伐他汀與洛伐他汀結(jié)構(gòu)上僅相差一個羥基，提取工藝上有值得相互借鑒之處。這都為我們提供了寶貴的經(jīng)驗，值得我們學(xué)習(xí)和借鑒。 土曲霉(Aspergillus terreus Z159)，購自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物生理研究室。將經(jīng)過輻照處理的孢子懸液稀釋至10104，吸取100μl涂布在固體平板培養(yǎng)基上，每個稀釋度涂布3個平皿，在30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)34d，挑取生長較快的單菌落接入試管斜面培養(yǎng)基保存?zhèn)溆?。采用超聲提取的方法以提?Lovastatin的提取效率。 由于 Lovastatin在 246nm、254nm兩波長下其吸光度之差（A246—A254）與其濃度的關(guān)系符合比爾定律。，隨著紫外照射時間的延長，菌株A. terreus Z159的致死率不斷增大，照射時間在100s180s范圍內(nèi)，A. terreus Z159的致死率都大于80%。A. terreus UV1503產(chǎn)Lovastatin的性能均比較穩(wěn)定，生物量也比較穩(wěn)定。177。177。 將誘變株A. terreus Z159和菌株A. terreus UV1503接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，每隔12h測定其生物量，誘變前后菌株的生長趨勢沒有什么變化，84h后均進入穩(wěn)定期，菌株A. terreus UV1503的在前60h生長較快，后略低于菌株A. terreus Z159。 A. terreus Z157和A. terreus UV1503的產(chǎn)物曲線4. 結(jié)論已經(jīng)研究的產(chǎn)Lovastatin絲狀真菌有Monascus、Aspergillus 和Penicillium 等，其中以Monascus ruber、Monascus pilosus(Miyake)、Aspergillus terreus、Aspergillus flavipes(Valera)等廣泛用于研究和生產(chǎn)。但傳統(tǒng)的物理化學(xué)誘變方法，因其具有簡單、快速、有效等優(yōu)點，至今仍被廣泛使用。參考文獻：[1]余志立, K的質(zhì)譜研究[J].質(zhì)譜學(xué)報,2000,21(1):6871.[2][J]．阜陽師范學(xué)院學(xué)報,2007,24(2)：2629.[3]李傳茂,黃國林,劉峙嶸,康文,俞自由．降血脂藥物新伐他汀的合成新工藝．2005,28(2):163165.[4]田潔,喬明武,左秀鳳,史燕強．紅曲發(fā)酵谷物麩糠提取 Lovastatin 的研究．現(xiàn)代食品科技,2006,89(3):111113.[5]毛寧,洪智勇. 紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生降脂物質(zhì)的研究. 福建師范大學(xué)學(xué)報,2003,19(3):5860.[6]姚菁華,王玨, 2008,36(24):1052410526.[7] 產(chǎn)生菌生物合成能力的研究[J].生物學(xué)雜志,2004,2(5):3839.[8]劉愛英, K含量的研究[J] .貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(6):57.[9]趙興秀,[J] .中國釀造,2010, (3):6669.[10]李仁民,王菊芳,. 原子核物理評論,2007,24(3):234235.[11]賈志華,張小里,. 化學(xué)工程,2008,36(5):5155.[12]蔡晶晶, [J].微生物學(xué)雜志,2000 ,20 (4) :14.[13]田歌,林永彬,2005,22(4):310312.[14]Kimura K,Komagata D,Murakawa of monacolins [J]. J ntibiot,1990,43 :16211622.[15]卜光明,鄭慶寶. ,2007,22(3):1518.[16][J].農(nóng)業(yè)與技術(shù),2004,24（6）:86—89.[17]周興挺,徐會根,[J].中國抗生素雜志,1999,24（1）：2223.[18]沈平,伍軍,李浩然,[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報, 2005, 20(3)：4751.[19]韓文愛,[J]. 石家莊職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報,2006,18(2):1113.[20]張小茜,周富榮,[J ].中國中藥雜志,1997,22 (4) :222 224.[21]張哲峰,鹿頤,[J].藥物分析雜志,1996,16(6)：373 375.[22]孫考祥,吳琳華,[J ].藥物分析雜志,1998 ,18 (3) :165167.[23]宋洪濤,[J ].中草藥,1997,28 (12) : 723 725.[24]張惠霞,李平,[J].藥物分析雜志,1999,19 (1) :60 61.[25]文鏡,羅琳, 的含量[J].中國食品添加劑,2002,(1) :69 74.[26]Jozica F,Mateja liquid chromatographic analysis of mevinolin as mevinolinic acid in fermentation broths[J ].Journal of Chromatography A,1995,