細(xì)胞生物學(xué)第三章ppt課件-wenkub
2023-05-27 12:51:51 本頁(yè)面
【正文】 請(qǐng)記 住 !!! 這個(gè)數(shù)值就是顯微 水平與亞（超）微水平的分界線。 ? 人肉眼分辨力測(cè)試，是規(guī)定在明視距離為 25cm所分辨的最短間距來(lái)表示，正常人肉眼分辨力的極限值是 mm毫米。顯微鏡的分辨力可按下列公式來(lái)計(jì)算 : ? R= λ / N〃A （ R是分辨距離， ， λ是照明光波波長(zhǎng)，N〃A 是顯微鏡物鏡的 鏡口率 — 光學(xué)性能指標(biāo)，每個(gè)物鏡的外殼上都標(biāo)有其鏡口率的數(shù)值）。 ?∵ 顯微鏡的分辨力有一定的極限， ∴ 其放大率受分辨力制約而不可能無(wú)限提高。 由于物鏡鏡口率受 入射鏡口角 和 介質(zhì)折射率 的限制， 不可能再更進(jìn)一步提高了。 對(duì)于光波波長(zhǎng)變化，肉眼覺(jué)察為顏色變化 。 ? 當(dāng)光線穿過(guò)無(wú)色透明且非勻質(zhì)的被檢物體（如活細(xì)胞），其波長(zhǎng)和振幅都無(wú)明顯變化，僅光相位出現(xiàn)了一定程度的變化，此時(shí)觀察會(huì)感覺(jué)反差較小，對(duì)物體內(nèi)部的結(jié)構(gòu)難分辨，這就是 普通光鏡不適宜用于觀察活細(xì)胞的原因。 ?倒臵顯微鏡 則是將相差顯微鏡的構(gòu)件顛倒裝配，本末倒臵而成的，并裝有恒溫設(shè)備、閉路電視和縮時(shí)攝象機(jī)，是能夠完善適用于 細(xì)胞培養(yǎng)的觀察監(jiān)視系統(tǒng)。 ?例：熒光染料 吖啶橙 ，可使 RNA發(fā)出紅色熒光，而使 DNA發(fā)出綠色熒光。 此外， 由于在熒光標(biāo)記檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中， 易發(fā)生一些非檢測(cè)目標(biāo)出現(xiàn)假象的 “背景噪音” 問(wèn)題， 因而現(xiàn)可在熒光顯微鏡設(shè)備上安裝一套“ 數(shù)字成像處理系統(tǒng) ” ，即把圖像信息通過(guò)攝像機(jī)和電腦的圖象數(shù)字化處理，使信號(hào)反差得以放大增強(qiáng)，對(duì)假象削弱或消除，從而明顯提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率和靈敏度。 第一組磁透鏡能將電子流聚集到樣品上 （ 故稱為會(huì)聚鏡），第二組磁透鏡能使穿透過(guò)樣品的電子射線折射形成初級(jí)放大象（稱為物鏡），而第三組磁透鏡則是通過(guò)第一、第二中間鏡和投影鏡進(jìn)行連續(xù)三次的再放大，最終投射到熒光屏上，使電子圖象轉(zhuǎn)變成可見(jiàn)的光學(xué)圖象。 ? （ 3） 具有高壓穩(wěn)壓系統(tǒng) 。故要求電鏡內(nèi)的工作系統(tǒng)（包括樣品室）都必須保持高度真空狀態(tài)， 并且樣品都必須脫水。這是因?yàn)殡娮哟┩改芰τ邢蓿瑯悠愤^(guò)厚則成象不清晰，并且高速穿透的電子會(huì)產(chǎn)生熱量，能將厚樣品燒出白斑。 電鏡標(biāo)本不是象光鏡標(biāo)本那樣染上各種顏色，而是使須觀察的結(jié)構(gòu)與背景之間，黑白對(duì)比分明，反差增強(qiáng)。 負(fù)染 則是使用磷鎢酸染色，使得背景較暗，而觀察的結(jié)構(gòu)顯得明亮突出。 ? （ 8） 冰凍蝕刻（或冰凍斷裂）技術(shù) ? 是研究細(xì)胞各種膜相結(jié)構(gòu)的處理方法。這是因?yàn)槿藶榈倪@種表面復(fù)型膜能比生物樣品本身具有更強(qiáng)的電子反差性能，能夠以富有立體感的浮雕形式精細(xì)地反映出某一斷裂面的細(xì)微結(jié)構(gòu)。 ?特點(diǎn)：不需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜處理，即可觀察標(biāo)本的原始外表面。這是目前開(kāi)展納米結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的重要技術(shù)， 已被應(yīng)用于直接觀察 DNA分子、 RNA分子、蛋白質(zhì)分子及生物體的微觀精細(xì)結(jié)構(gòu)。 其原理是， 經(jīng)稀鹽酸水解打開(kāi) DNA上嘌呤堿與脫氧核糖之間的連接鍵，暴露出醛基，由于自由醛基能與無(wú)色品紅（希夫試劑）反應(yīng)形成紫紅色的化合物，據(jù)此可對(duì)細(xì)胞內(nèi)的 DNA進(jìn)行 定性 和 定位 檢測(cè)。如果標(biāo)記物是熒光素，則是在熒光顯微鏡下檢查熒光信號(hào)部位，以顯示抗原所存在的位臵。 例如， 辣根過(guò)氧化物酶 是常被用作標(biāo)記物的酶， 該酶可催化過(guò)氧化氫與 二氨基聯(lián)苯胺 發(fā)生氧化反應(yīng)，形成棕色的沉積物，從而便于在光鏡或電鏡下進(jìn)行觀察分析。目前，最先進(jìn)的顯微光譜分析儀器是 流式細(xì)胞儀 ，它是采用激光作為光譜測(cè)量光源，還采用了細(xì)胞流動(dòng)系統(tǒng)和電腦數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，所以，一秒鐘可測(cè)定 5000個(gè)細(xì)胞的多種參數(shù)，例如 DNA含量、蛋白質(zhì)含量、 細(xì)胞體積和直徑等等 , 此外還可將含不同成分的細(xì)胞迅速大量分離。由于此技術(shù)靈敏度很高，是對(duì)生物大分子進(jìn)行精細(xì)定位的有效方法。超離心可達(dá)幾萬(wàn) —— 幾十萬(wàn)轉(zhuǎn) /分（ g）的高轉(zhuǎn)速，各種細(xì)胞亞微顆粒在離心場(chǎng)中的沉降速率不一樣，衡量各種物質(zhì)顆粒在單位強(qiáng)度離心場(chǎng)中沉降速率的量度，稱為 沉降系數(shù) 。 ? 密度梯度離心 density gradient centrifugation ? 首先將離心溶液制備成連續(xù)或不連續(xù)增高的密度梯度，其密度變化的范圍與待分離顆粒的密度大致相當(dāng)，然后通過(guò)一段時(shí)間離心操作后，不同密度的顆粒就會(huì)分別集中于與其相應(yīng)的密度梯度區(qū)帶之中，而得以分離。然后在離心過(guò)程中，這些顆粒會(huì)在蔗糖濃度梯度中徐徐沉降， 當(dāng)沉降達(dá)到平衡狀態(tài)時(shí)，不同類型的顆粒便會(huì)分別集中在與其對(duì)應(yīng)的濃度區(qū)帶之中。即在離心操作前，將待分離的生物大分子懸液加入氯化銫溶液中。膜電位的變化能反映細(xì)生理變化， 譬如當(dāng)神經(jīng)興奮信號(hào)傳導(dǎo)時(shí)，或肌肉收縮運(yùn)動(dòng)時(shí)，膜電位都會(huì)發(fā)生顯著變化。 ?（二）細(xì)胞電泳 ?cell electrophoresis ? 細(xì)胞表面的分子具有電荷基團(tuán)，因此在外加電場(chǎng)作用下，懸液中的細(xì)胞都會(huì)朝正極泳動(dòng)，這稱為細(xì)胞
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