現(xiàn)代生物學方法論ppt課件-wenkub
2023-05-27 12:28:02 本頁面
【正文】 分析基因表達（ SAGE） 分子量大小：凝膠電泳 ? 合成 從頭合成：寡聚核苷酸的合成 基因擴增： PCR反應 概述 ? 其他核酸技術(shù) 測序 基因的表達與克隆 印記雜交（ Southern與 Northern） 生物芯片 熒光原位雜交 啟動子技術(shù) √ SELEX技術(shù) √ 反義技術(shù) √ RNAi技術(shù) √ 非編碼 RNA √ 核酸的生物信息學 √ 概述 一、反義技術(shù) ? 反義技術(shù)的概念 ? 反義技術(shù)的分子機制 ? 反義核酸的設(shè)計及注意事項 ? 核酶 ? 脫氧核酶 反義技術(shù)概述（ antisense technology) 反義技術(shù)是根據(jù)核酸雜交原理特異性抑制特定基因 (mRNA)表達的一種生物技術(shù)，包括反義 RNA、反義 DNA、核酶以及脫氧核酶。 2） 結(jié)合激活不穩(wěn)定的機制。 反義核苷酸設(shè)計原則： 核酶 （ Ribozyme,catalytic RNA, RNA enzyme、 RNAzyme） 具有催化活性的 RNA分子 1981年 Cech發(fā)現(xiàn)四膜蟲前體 rRNA可以在沒有蛋白質(zhì) 存在的情況下自身催化切除內(nèi)含子，完成加 工過程。 2 剪切自身或異體 RNA序列中的保守位點的磷酸二酯鍵， 相當于內(nèi)切核酸酶，產(chǎn)物帶有 5’ OH和 2’ ， 3’ 環(huán)狀膦酸酯。 最小錘頭核酶由三個結(jié)構(gòu)域組成： 1 分裂結(jié)構(gòu)域 GUX（ X可以是 A、 U、 C但不可以為 G） 2 催化結(jié)構(gòu)域：其中有 13個核苷酸是保守的 2 底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域 1. 二價金屬陽離子（種類、離子強度） 2. 溫度 3. pH值 ? 影響 錘頭核酶 活性的主要因素 自身剪接類核酶： I類內(nèi)含子、 II類內(nèi)含子、類 I類內(nèi)含子（ groupI likeintron)GIR1分支核酶和剪接體，以及具有 3’ ， 5’ RNA連接酶活性的天然核酶 I類內(nèi)含子的 特征： ? 長度 1404200nt，剪接位點序列為 5’U… G3’ ? 催化核心是保守的 ? 有內(nèi)部的引導序列（ IGS） ? 通過轉(zhuǎn)酯反應實現(xiàn)自身的剪接，需要輔因子 II類內(nèi)含子特征 ： ?最大的核酶之一，長度為 4001000nt。 1 RNP核酶：由一個催化 RNA和多個蛋白質(zhì)組成， RNase P、剪接體和核糖體等。 ? 1994年 Breaker R R 與 Joyce G F通過體外篩選得到具有催化活性的 DNA Breaker R R Joyce G F 與核酶相比，脫氧核酶具有明顯的優(yōu)勢： 1 相對分子質(zhì)量小，合成成本低，穩(wěn)定性高，選擇性強， 不僅可以精確的切割或連接底物 RNA/DNA，而且可以 催化更廣泛的化學反應。 ? 影響 10－ 23脫氧核酶 活性的主要因素 1. 活性中心核苷酸的組成 2. 二價金屬陽離子（種類、離子強度） 3. 反義臂長度與核苷酸組成 4. 效應物分子的作用 ? 8－ 17結(jié)構(gòu)脫氧核酶 1 原型酶只分裂底物 5’A↓G3’， A不與脫氧核苷 酸配對 2 靶部位的下游有? rGdT”擺動配對。 單鏈 DNA載體 M13mp18 1023結(jié)構(gòu)脫氧核酶 編碼錘頭核酶 DNA 1023結(jié)構(gòu)脫氧核酶 單鏈 DNA載體 pBluescript II KS(+) Hammerhead ribozyme activity DNAzymeRNAzyme 錘頭核酶 單鏈 DNA cRDE 1023 DNAzyme activity Transcription in vitro pepzyme activity Circular DNAzymes 環(huán)狀脫氧核酶 核酶復合酶的構(gòu)建 核酶與脫氧核酶的轉(zhuǎn)換 核酶與脫氧核酶的轉(zhuǎn)換 conversion 雙功能脫氧核酶的設(shè)計與構(gòu)建 二 RNA干涉 (RNA
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