雙向凝膠電泳技術(shù)ppt課件-wenkub
2023-05-27 06:52:37 本頁面
【正文】 在分離蛋白混合樣品，比較差異方面有不可替代的作用，結(jié)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)可查明大型蛋白復(fù)合物各組組分，與其他生物技術(shù)如分子生物學(xué)，分子遺傳工程，免疫學(xué)，微量蛋白質(zhì)的自動氨基酸序列分析相結(jié)合，可以快速準確的 發(fā)現(xiàn)和鑒定新的蛋白質(zhì)。目前增加蛋白質(zhì)溶解性的方法主要是適用變性劑，如尿素、硫脲，可以打破蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，打斷非共價連接。但有幾條共同的原則需要遵循 （ 1）盡可能溶解全部蛋白質(zhì)，打斷蛋白質(zhì)之間的非共價鍵結(jié)合， 使樣品中的蛋白質(zhì)以分離的多肽鏈形式存在 （ 2）避免蛋白質(zhì)的修飾作用和蛋白質(zhì)的降解作用 （ 3）避免脂類、核酸、鹽等物質(zhì)的干擾作用 （ 4）蛋白質(zhì)樣品與第一向電泳的相容性。第二向為十二烷基硫酸鈉 聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDSPAGE),它是按蛋白質(zhì)分子量的大小進行分離的 ,再用考馬斯亮蘭或 P銀染進行檢測，經(jīng) Pdquest等軟件對結(jié)果進行對比，解析。 ? 定義二 ：根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點和分子量大小，分別在凝膠介質(zhì)二維空間上對蛋白質(zhì)分子進行等電點聚焦和電泳來分離與純化蛋白質(zhì)的方法。 雙向凝膠電泳的原理 ：該技術(shù)是在 1975年由意大利生化學(xué)家 O’Farrell 發(fā)明的。 2DPAGE技術(shù)應(yīng)用中的關(guān)鍵步驟： 樣品制備（蛋白提?。? （ 1）細胞培養(yǎng)、 處理 和收集； （ 2）將細胞在 IEF裂解緩沖液中 溶解 ； （ 3）將樣品離心以去除不容的細胞碎片和 DNA，提取上 清， 80 ℃ 保存。 蛋白質(zhì)樣品處理： 在制備蛋白質(zhì)樣品的過程中，最好適用 Dnase（脫氧核糖核酸酶）和 RnaseA（核糖核酸酶）來降解核酸。 雙向電泳的應(yīng)用 雙向電泳的分辨率較高，自第一次應(yīng)用該技術(shù)以來，其分辨率已從 15個蛋白質(zhì)點發(fā)展到 10000多個蛋白質(zhì)點。 雙向凝膠電泳技術(shù)當前面臨的挑戰(zhàn)是： (1)低拷貝蛋白的鑒定。
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