【正文】 通過專用滅菌裝置，連續(xù)不斷加熱，維持保溫和冷卻后，送入已滅菌的發(fā)酵罐內(nèi)的工藝過程，又稱連消。 該法多用于中小型發(fā)酵罐和種子罐的滅菌。 適用范圍：沒有使用的發(fā)酵罐、染菌罐、發(fā)酵罐更換菌種、培養(yǎng)基連續(xù)滅菌工藝、發(fā)酵罐及附屬設備。 二、濕熱滅菌原理 熱阻 :指某一微生物在某一種特定條件（主要是溫度和加熱方式）下的致死時間。 金屬小鑷子、小刀、玻璃涂棒、載玻片、蓋玻片滅菌時，應先將其浸泡在 75%酒精溶液中，使用時從酒精溶液中取出來，迅速通過火焰，瞬間灼燒滅菌。不適用于培養(yǎng)基的滅菌。少量培養(yǎng)基的 PH值可用緩沖液加以緩沖。 二、培養(yǎng)基原材料質(zhì)量的影響 有機氮源（黃豆餅粉、玉米漿）、配制培養(yǎng)基（蛋白胨）、碳源（油脂） 消除原則：在工業(yè)生產(chǎn)中必須嚴加控制，按質(zhì)量標準進行分析檢驗，合乎標準的原材料方能使用。 固體培養(yǎng)基： 微生物菌種的分離、純化及保存、菌落特征鑒定、活細胞數(shù)目測定 根據(jù)微生物的營養(yǎng)特點選擇培養(yǎng)基 依據(jù)生產(chǎn)實踐和科學實驗的要求選擇培養(yǎng)基 考慮培養(yǎng)基的成本 選擇原則： ①產(chǎn)物或菌體得率大的 ②降低產(chǎn)品的分離提純成本 ③生產(chǎn)能力最高的 ④副產(chǎn)品生成最少 ⑤原料質(zhì)量穩(wěn)定，供應充足 ⑥工藝過程較易進行 第四節(jié) 影響培養(yǎng)基質(zhì)量的因素 一、培養(yǎng)基組成配比的影響 二、培養(yǎng)基原材料質(zhì)量的影響 三、水質(zhì)的影響 四、滅菌的影響 五、其他因素的影響 一、培養(yǎng)基組成配比的影響 ? 氮源過多：菌體生長旺盛， PH值偏高，不利于代謝產(chǎn)物積累。 營養(yǎng)成分：葡萄糖、糊精、蛋白胨、玉米漿、酵母粉、硫酸銨等。 第二節(jié) 培養(yǎng)基的類型 類別：按組成成分分 合成培養(yǎng)基：成分明確、穩(wěn)定，多用于研究和育種，不適合大規(guī)模生產(chǎn)。 一、碳源 工業(yè)常用： 糖蜜（營養(yǎng)豐富，物美價廉） 玉米淀粉及其水解液（克服葡萄糖代謝過快的弊?。? 油脂（消除泡沫） 糊精 第一節(jié) 培養(yǎng)基的成分 二、氮源 有機氮源： 黃豆餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、蛋白胨、酵母粉、魚粉 無機氮源： 銨鹽、硝酸鹽、氨水 三、無機鹽和微量元素 ? 磷（鏈霉素、四環(huán)素） ? 硫（青霉素、頭孢菌素） ? 鐵（青霉素、四環(huán)素、麥迪霉素） ? 鎂（卡那霉素、新生霉素、鏈霉素） ? 鋅（鏈霉素、青霉素） ? 氯（金霉素、灰黃霉素） 四、前體 前體是指加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中的能夠直接被微生物在生物合成過程中結(jié)合到產(chǎn)物分子中去而自身結(jié)構(gòu)沒有顯著變化的一類小分子物質(zhì)。 菌種保藏三要素 ?典型菌種的優(yōu)良純種的休眠體； ?創(chuàng)造有利于種子休眠的環(huán)境（低溫、干燥、缺氧、避光、缺少營養(yǎng)）； ?盡可能采用多種不同的手段保藏同一菌株。 真菌之青霉屬 (Penicillum) 產(chǎn)黃青霉 (Penicillum chrysogenum) 生產(chǎn)青霉素，也可用來生產(chǎn)葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸、檸檬酸和抗壞血酸 真菌之頭孢霉菌屬(Cephalosporium) ?產(chǎn)黃頭孢霉 (Cephalosporium chrysogen)、 ?頂孢頭孢霉菌 (Cephalosporium acremonium) 都生產(chǎn)頭孢菌素 C 第二節(jié) 制藥微生物的育種 ?菌種選育 ?菌種篩選 ?菌種保藏 ?菌種的退化和復壯 一、發(fā)酵菌種的選育要求 ?生產(chǎn)力：能在廉價的培養(yǎng)基上迅速生長，所需的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量高，其它類似代謝產(chǎn)物少 ?操作性：培養(yǎng)條件簡單，發(fā)酵易控制，產(chǎn)品易分離 ?穩(wěn)定性：抗噬菌體能力強，菌種純粹，遺傳性狀穩(wěn)定、不易變異退化 ?安全性：非病源菌，不產(chǎn)有害生物活性物質(zhì)或毒素 發(fā)酵菌種的選育方法 ?從自然界中獲得新菌種 ?誘變育種 ?雜交育種 ?原生質(zhì)體融合 ?基因工程 （ 1）從自然界中獲得新菌種 ?土壤、空氣、動植物等，嚴重污染的水域，極端環(huán)境等 ?基本程序： 采樣 ?預處理 ?富集培養(yǎng) ?篩選 ?鑒定 ?野生型菌株 （ 2）誘變育種 ?物理或化學方法誘發(fā)突變 ?物理誘變劑：紫外線、 X射線、 γ 射線等 ?化學誘變劑：氮芥、亞硝酸、 5氟尿嘧啶等 ?雜交育種 ：借助有性重組，使不同菌株的遺傳物質(zhì)得以交換 ?原生質(zhì)體融合育種 ：借助原生質(zhì)融合技術(shù)實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的交換 ?基因工程育種 ： DNA體外重組技術(shù)定向育種，技術(shù)含量高，應用面廣 二、菌種篩選 （ 1） 隨機篩選 搖瓶篩選法、瓊脂塊篩選法 （ 2）理性化篩選 篩選前體或前體結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株 篩選營養(yǎng)缺陷型突變株 三、菌種保藏 (Culture conservation) 目的：保證菌種經(jīng)過較長時間后仍保持生活能力，防止被雜菌污染，形態(tài)特征和生理形狀盡可能不發(fā)生變異。 ? 主要討論用于各類藥物發(fā)酵的微生物來源和改造、微生物藥物的生物合成和調(diào)控機制、發(fā)酵工藝與主要參數(shù)的確定、藥物發(fā)酵過程的優(yōu)化控制、質(zhì)量控制等。自此以后制藥業(yè)走進了抗生素時代 ?我國微生物發(fā)酵制藥工業(yè)起步較晚， 1953年，我國第一家青霉素生產(chǎn)廠 — 上海第三制藥廠才建成投產(chǎn)。未經(jīng)治療鼠在 24小時內(nèi)死亡，治療鼠存活數(shù)天至數(shù)周。 ?1929： Fleming在葡萄球菌培養(yǎng)皿中，污染的霉菌周圍出現(xiàn)透明的抑菌圈。一、概述 利用微生物技術(shù)，通過高度工程化的新型綜合技術(shù)，以利用 微生物反應 過程為基礎，依賴于微生物機體在反應器內(nèi)的 生長繁殖及代謝過程 來合成一定產(chǎn)物，通過 分離純化 進行提取精制，并最終制劑成型來實現(xiàn)藥物產(chǎn)品的生產(chǎn)。 ?殺菌物質(zhì)，斷言太不穩(wěn)定，無法分離并用作藥物。 ?1941年 2月開始治療第一批人類病人。 ?1958年，我國最大的抗生素制藥企業(yè) — 華北制藥廠在石家莊建成投產(chǎn)，主要產(chǎn)品為青霉素、鏈霉素、土霉素和紅霉素等。 第一章 微生物藥物的產(chǎn)生菌 常見的制藥用微生物 細菌 放線菌 真菌 細菌之 芽孢桿菌屬 (Bacillus) 放線菌 抗生素 12022余種， 60%左右來自放線菌，經(jīng)濟價值大。 原理：根據(jù)微生物的生理、生化特性，人工創(chuàng)造條件（如干燥、低溫、缺氧、缺乏營養(yǎng)等）使微生物代謝活動處于不活潑狀態(tài)，使其存活且得以延續(xù)。 菌種保藏的常用方法 ?斜面低溫保藏法 ?石蠟油封存法 ?砂土管保藏法 ?麩皮保藏法 ?甘油懸液保藏法 ?冷凍真空干燥保藏法 ?液氮超低溫保藏法 ?宿主保藏法 方法名稱 主要特點 適用范圍 保藏期 斜面低溫保藏法 傳代培養(yǎng)， 4℃ 保藏 各種微生物的短期保藏。 注意：少量多次 五、促進劑和抑制劑 促進劑是指那些既不是營養(yǎng)物質(zhì)又不是前體卻能提高產(chǎn)物產(chǎn)量的添加劑。 天然培養(yǎng)基：天然動植物產(chǎn)品，營養(yǎng)豐富、價格低廉、適于工業(yè)生產(chǎn)。 三、發(fā)酵培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基是供菌種生長、繁殖和合成產(chǎn)物用的培養(yǎng)基。 ? 氮源不足：菌體繁殖量過少，影響產(chǎn)量。 三、水質(zhì)影響 孢子培養(yǎng)基用蒸餾水貨深井水，種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基用深井水或自來水，發(fā)酵生產(chǎn)中有的使用地表水，但是必要時要經(jīng)過適當處理才能使用。 培養(yǎng)基的黏度 黏度適宜 第三章 滅菌 第一節(jié) 滅菌的原理和方法 滅菌是指用物理的或化學的方法殺滅或除掉物料及設備中所有生命有機體的過程。 輻射滅菌 用于滅菌的射線包括紫外線、 X射線、 γ射線，其中以紫外線最常用。 熱空氣滅菌 生產(chǎn)上常用的滅菌條件為 160170℃ 、 。 相對熱阻：指某一微生物在某條件下的致死時間與另一微生物在相同條件下的致死時間的比值。 （二）實罐滅菌 實罐滅菌又稱為分批滅菌，是將飽和蒸汽直接通入裝有配制好的培養(yǎng)基的發(fā)酵設備中進行滅菌的一種方法，簡稱實消。 注意： 原料切忌結(jié)塊，配料時應開動攪拌器，將各種粉餅塊打碎、攪拌均勻。 優(yōu)點：發(fā)酵罐利用率高；熱能利用較合理，適于自動化控制。 由熱交換器組成的滅菌系統(tǒng) 板式熱交換器傳熱系數(shù)大，流程利用合理，節(jié)省大量的蒸汽和冷卻水，因而廣泛利用。 （二）空氣過濾器的滅菌 滅菌時，總蒸汽壓力為（ ） 105Pa，總過濾器保溫滅菌時間為 ，吹干時間為 24h；中小型過濾器一般保溫 4560min，吹干需 12h。 第三節(jié) 常見滅菌問題的分析及處理 一、影響培養(yǎng)基滅菌的因素 ①培養(yǎng)基成分 油脂、糖類、蛋白質(zhì)、有機物需要滅菌溫度高；鹽類、色素有利于滅菌的進行。處理順序：發(fā)酵罐 → 種子罐 →補料罐 → 消沫劑罐 → 計量罐。 菌體總量及濃度能滿足發(fā)酵罐接種量的要求。 一、孢子制備的過程 霉菌孢子制備 多數(shù)采用大米、小米、麥麩之類的自然培養(yǎng)基。 ? 產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，如產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌（ S． griseus ），產(chǎn)卡那霉素的卡那鏈霉菌 （ S． kanamyceticu），可以用搖瓶液體培養(yǎng)法，孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖床上培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種子。 二、孢子制備的技術(shù)要點 霉菌類 菌落分散、挑選菌落中央的孢子、孢子懸液濃度適當、混合均勻。 生產(chǎn)種子的制備包括：搖瓶種子制備和種子罐種子制備。 培養(yǎng) 搖瓶種子在恒溫搖床上進行培養(yǎng)。 二、種子罐種子制備 種子罐的作用是使接入種子罐內(nèi)數(shù)量有限的孢子發(fā)芽、生長并繁殖成大量菌體，滿足接種發(fā)酵罐的需要。 接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中的繁殖速度。 . 嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶 接種 1%，酶活最高； %~4%影響不大；大于 4%，酶產(chǎn)量明顯下降。 ③ 培養(yǎng)時間 過于年輕的孢子經(jīng)不起冷藏，過于衰老的孢子會導致生產(chǎn)能力下降，孢子的培養(yǎng)時間應控制在孢子量多、孢子成熟、發(fā)酵產(chǎn)量正常的階段終止培養(yǎng) 。 培養(yǎng)條件 選擇最適溫度；前期需氧量較少，后期需氧量較多，應適當增大供氧量；補料工藝 種齡 在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，一般都選在生命力最旺盛的對數(shù)生長期，菌體量尚未達到最高峰時移種。 菌絲結(jié)團 菌絲結(jié)團和攪拌效果差、接種量小有關(guān)。 青霉素發(fā)酵菌絲體的生長期共分 6期， 14期為年青期， 46期合成青霉素的能力最強。 玻璃纖維 阻力小 二、顆?；钚蕴窟^濾介質(zhì) 該介質(zhì)過濾強度高，表面積大，空隙大，阻力小，過濾效率低，只有棉花阻力的 1/12，常與棉花配合使用 。 聚丙烯纖維濾紙 結(jié)構(gòu)強度好，不易被水汽浸潤。耐121℃ 反復蒸汽滅菌，公認的最安全，保險。 壓縮：渦輪空壓機和往復式空壓機 壓縮空氣除油水 氣液分離器：旋風分離器和絲網(wǎng)過濾器，一般聯(lián)合使用 。 第四節(jié) 無菌空氣的微生物檢測