煙草實(shí)驗(yàn)操作手冊--wenkub
2022-11-09 08:10:51 本頁面
【正文】 準(zhǔn)曲線 管號 1 2 3 4 5 6 7 亞硝酸納標(biāo)準(zhǔn)液 ml 00 02 04 08 12 16 20 蒸餾水 ml 20 18 16 12 08 04 00 1 磺胺 ml 40 40 40 40 40 40 40 002 萘基乙烯胺 ml 40 40 40 40 40 40 40 每管含亞硝態(tài)氮μ g 00 02 04 08 12 16 20 二樣品測定 酶的提取取鮮樣 05g剪碎于研缽中 置于低溫冰箱 30min取出置冰浴中 加少量石英砂及 4ml提取緩沖液研磨成漿 4℃ 4000rpm離心 5min上清液為粗酶提取液 酶的反應(yīng)取提取液 04 ml 于 10 ml 試管加入 12 ml 01molL KNO3 溶液和04mlNADH 溶液混勻 25℃水浴中保溫 30min 對照不加 NADH 溶液而以 04ml 01molL pH75 的磷酸緩沖液代替 保溫結(jié)束后立即加入 1 ml 磺胺終止酶反應(yīng)再加 1ml 萘基乙烯胺溶液顯色15min 后 4000rpm 離心 5min 取上清液測吸光值 四．結(jié)果計算 [μg g h ] 式中 x 為反應(yīng)液酶催化產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮總量 μ g V1 為提取酶時加入的緩沖液體積 ml V2 為酶反應(yīng)時加入的粗酶液體積 ml W 為樣品鮮重 g t 為反應(yīng)時間 h 23 蔗糖轉(zhuǎn)化酶測定 35二硝基水楊酸法張言芳 一儀器設(shè)備 紫外可見分光光度計容量瓶 100 ml 移液器離心管和離心機(jī) 水浴鍋溫度計烘箱濾紙?zhí)炱?25 ml 的具塞試管 二試劑 1 mgml 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確稱取 100 mg 無水葡萄糖預(yù)先在 105℃干燥至恒重用少量水溶解后轉(zhuǎn)移到 100 ml 容量瓶中定容至刻度搖勻 100 gL NaOH 水溶液 DNS 試劑 精確稱取 35－二硝基水楊酸 1 g 溶于 20 ml 1 molL NaOH 中加 50 ml 蒸餾水再加入 30g 酒石酸鉀鈉溶解后蓋緊瓶塞勿使 CO2 進(jìn)入 磷酸鹽緩沖溶液 pH6801 molL Na2HPO4 491 ml 和 01 molL KH2HPO4 509 ml混勻 100 gL 蔗 糖溶液稱取 10 g 蔗糖溶于少量水中轉(zhuǎn)入 100 ml 容量瓶中加 10 ml磷酸鹽緩沖溶液 pH68 用水稀釋至刻度 二實(shí)驗(yàn)步驟 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 00204060810 ml 相當(dāng)于 00204060810mg 葡萄糖分置 6 支 25 ml 的具塞比色管中各加水至 20 ml 各加 35二硝基水楊酸試劑 15 ml置沸水浴中 5 min 取出后立即用冷水冷卻至室溫再用水將各管定容至刻度 立即于 520 nm 波長處用 1 cm 比色皿以試劑空白作參比測定吸光度根據(jù)測得的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或計算直線回歸方程 2 蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性 的測定 稱取 05 g 煙葉用水研磨并定容至 6 ml 然后在 3000 rmin 離心 10 min 定容由后面的吸光值確定定容多少體積 混合液吸取 10 ml 酶液和 10 ml 蔗糖溶液混勻吸取此混合溶液 5 ml 用水稀釋并定容至 100 ml 容量瓶中 轉(zhuǎn)化液取混合液 8 ml 于 45℃水浴中轉(zhuǎn)化 1 h 取出立即快速冷卻至室溫吸取混合液和轉(zhuǎn)化液各 1 ml 分置 25 ml 的具塞試管中各加水至 2 ml 各加 35 二硝基水楊酸試劑 15 ml 在沸水溶中 5 min 取出后立即用水冷卻至室溫再用水將各管定容至刻度立即于 520 nm 波長處用 1 cm 比色皿以 試劑空白作參比測定吸光度 3 計算 N nAWV200 M nAWV200 蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性 mgg 102 MN 式中 M 轉(zhuǎn)化后單糖 mgg N 轉(zhuǎn)化前單糖 mgg A 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的葡萄糖含量 mg W 樣品質(zhì)量 g V 測定用樣品體積 ml N 稀釋倍數(shù) 蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性單位 mgg 在 1g 煙葉作用下能使蔗糖轉(zhuǎn)化為單糖的 mg 數(shù) 24 蔗糖合酶孔霖 一實(shí)驗(yàn)原理 蔗糖合酶催化反應(yīng) UDPG 果糖 蔗糖 UDP 這是一個可逆反應(yīng)平衡常數(shù)為 1320 該酶在分解方向的 Km 值相對 較高30150mmolL 細(xì)胞中高的蔗糖濃度有利于反應(yīng)向分解方向進(jìn)行蔗糖合酶活性測定既可在合成方向進(jìn)行測定外加底物 UDPG 和果糖測產(chǎn)物蔗糖的量表示酶活性也可以在分解方向進(jìn)行測定外加蔗糖和 UPD 測定果糖含量表示酶活性 二儀器設(shè)備及設(shè)備 冷凍離 心機(jī) 恒溫 水浴 分光 光度計 研缽 一套 磁力 攪拌 器天 平感量001mg010515 ml 移液管各 1 個 10ml 具塞試管 10 支 5ml 量瓶一個冰箱 三試劑配制 1 提取緩沖液 100 mmolL TrisHCl pH70 緩沖液內(nèi)含 5 mmolL MgCl2 2mmolL EDTANa2 2 乙二醇 02 牛血清蛋白 BSA2 PVP5 mmolL DTT 2 透析緩沖液 25mmolL TrisHCl pH70 緩沖液內(nèi)含 25mmolL MgCl2 1mmolL EDTANa2 1 乙二醇 1mmolL DTT 3 酶反應(yīng)液 100mmolL TrisHCl pH70 緩沖液內(nèi)含 10mmolL 果糖 2mmolL EDTANa2 5mmolL 醋酸鎂 5mmolL DTT 4 10mmolL UDPG 稱取 0012206 g UDPG 配成 2ml 濃度計為 10molL UDPG 隨配隨 用 5 2molL NaOH 6 30 HCl 7 01 間苯二酚 01g 間苯二酚溶于 100ml 95 乙醇中棕色瓶保存 8 1mgml 蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液 四實(shí)驗(yàn)步驟 1 酶液制備 稱取 1g植物葉片置于預(yù)冷的研缽中分批加入 5ml提取緩沖液冰浴研磨提取 2℃ 10000 轉(zhuǎn)離心 20min 上清液 3ml 裝入透析袋中透析袋置于透析緩沖液中 4℃透析過夜期間更換透析液 3 次透析后酶液定容 5ml 備用 2 蔗糖合酶活性測定取 3 支 10ml 具塞試管加入 04ml 酶反應(yīng)液 01ml UDPG和 005ml 透析后的酶液補(bǔ)水至 1ml 于 30℃水浴中反應(yīng) 10min 后沸水浴 3min 中止反應(yīng)對照用蒸餾水代替 UDPG 3 蔗糖含量測定往各反應(yīng)試管中加入 2molL NaOH 01 ml 沸水浴 10 min 后冷卻至室溫加 3
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