【正文】 的 百分比 必須 大于加水比 才能認為有效，即若加水一倍，則稀釋后液體的粘度必須下降 50％以上才能有效提高過濾速率。 2．改變發(fā)酵液過濾特性的主要方法有哪些 ?其簡要機理如何 ? 有關(guān)改善發(fā)酵液過濾特性的物理化學(xué)方法有： 調(diào)酸（等電點）、熱處理、電解質(zhì)處理、添加凝聚劑、添加表面活性物質(zhì)、添加反應(yīng)劑、冷凍 解凍及添加助濾劑 等。 6．清潔生產(chǎn) (Cleaner Production） ？ 清潔生產(chǎn)（ Cleaner Production）是指將綜合預(yù)防的環(huán)境保護策略持續(xù)應(yīng)用于生產(chǎn)過程和產(chǎn)品中，以期減少對人類和環(huán)境的風(fēng)險。下游技術(shù)的步驟越多，提取收得率也越低。 （ 3） 精制（高度純化） 目的是除去與產(chǎn)物的物理化學(xué)性質(zhì)比較接近的雜質(zhì)。 如下圖所示。生物大分子的純化一直是個難題。細胞破碎技術(shù)的逐漸成熟，使得胞內(nèi)生物物質(zhì)的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)成為可能。這期間借鑒和引進吸收了大量的近代化學(xué)工業(yè)的分離技術(shù)，據(jù)報道有 80%的化工單元操作技術(shù)被引入生物工業(yè)。此時開始引入化學(xué)工程中成熟的近代分離技術(shù)，如過濾、蒸餾、精餾等。 2．生物工程下游技術(shù)的發(fā)展歷程？ (1)、 古代釀造業(yè) 生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的歷史可追溯到古代的釀造業(yè)，它包括釀酒、制醬（油）、醋、酸奶和干酪等。 1 第一章 緒論 1．什么是生物工程的下游技術(shù)？ 對于由生物界自然產(chǎn)生的或由 微生物菌體發(fā)酵的動植物細胞組織培養(yǎng)的，酶反應(yīng)等各種生物工業(yè)生產(chǎn)過程獲得的生物原料，經(jīng)提取分離，加工并精制目的成分，最終使其成為產(chǎn)品的技術(shù)，通常稱為下游技術(shù)（ Downstream Processing），也成為下游工程或下游加工過程。古代的技術(shù)比較原始，工場大多是家庭作坊式的，產(chǎn)物基本不經(jīng)過后處理而直接使用，當然也就沒有上下游技術(shù)之說了。 (3)、第二代生物技術(shù) 第二代生物技術(shù)以 20 世紀 40 年代出現(xiàn)的青霉素產(chǎn)品為代表。 (4)、第三代生物技術(shù) 第三代生物技術(shù)一般認為以 20 世紀 70 年代末掘起的 DNA 重組技術(shù)及細胞融合技術(shù)為代表。 初步分離純化技術(shù) 主要開發(fā)了沉淀、離子交換、萃取、超濾等技術(shù)。 70 年代以來，逐漸開發(fā)出各種色譜 (層析 )技術(shù)，如親和色譜、疏水色譜、聚焦色譜、離子交換色譜和凝膠色譜等，后兩種技術(shù)已開始用于批量生產(chǎn)。 （胞外產(chǎn)物） （胞內(nèi)產(chǎn)物） 發(fā)酵液 預(yù)處理 細胞分離 細胞破碎 碎片分離 提取 精制 成品制作 加熱 過濾 勻漿法 離心 沉淀 （重）結(jié)晶 濃縮 調(diào) pH 離心 研磨法 雙水相 吸附 離子交換 干燥 絮凝 膜分離 酶解法 膜分離 萃取 色譜分 離 無菌過濾 超濾 膜分離 成型 結(jié)晶 圖 11 生物工業(yè)下游技術(shù)一般工藝過程 按生產(chǎn)過程的 4 個階段可對下游技術(shù)作如下簡單歸納： （ 1） 預(yù)處理和固液分離 主要技術(shù)有過濾和離心。 （ 4） 成品制作 成品形式與產(chǎn)品的最終用途有關(guān)。 如整個下游過程包括 6 步操作，每步操作的分步收率為 90％，則總收率僅為 ()6 100％ =％，即 使各步操作都相當完善，分步收率均達到 95％，經(jīng) 6 步操作后，總收率也只有 ()6 100％ =％。它包括三方面內(nèi)容： 即 清潔生產(chǎn)工藝（技術(shù)）、清潔產(chǎn)品、清潔能源 。 一、降低液體粘度 根據(jù)流體力學(xué)原理，濾液通過濾餅的 速率 與液體的 粘度 成 反比 ，可見 降低液體粘度 可有效提高過濾速率。 升高溫度可有效降低液體粘度 ，提高過濾速率，如 12176。如鏈霉素發(fā)酵液，調(diào)酸至 pH 后，加熱至 70℃，維持半小時，液相粘度下降至1/6，過濾速率可增大： 10～ 100 倍。此法是發(fā)酵工業(yè)中發(fā)酵液預(yù)處理較常用的方法之一。 對于蛋白質(zhì)，由于羧基的電離度比氨基大，故 蛋白質(zhì)的酸性性質(zhì)通常強于堿性 ，因而大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點都在酸性范圍內(nèi) (～ )。 等電點法提取工藝 操作簡單，收率 60％。 凝聚 是指在電解質(zhì)作用下，由于膠粒之間雙電層電排斥作用降低，電位下降，而使膠體體系不穩(wěn)定的現(xiàn)象。這種雙電層的結(jié)構(gòu) 使膠粒之間不易聚集而保持穩(wěn)定的分散狀態(tài) 。 根據(jù) SchuzeHardy 法則， 反離子的價數(shù)越高，凝聚值就越小，即凝聚能力越強 。6H三氯化鐵 FeCl3采用絮凝法則?？尚纬?粗大的絮凝體，使發(fā)酵液較易分離。 對絮凝劑的 化學(xué)結(jié)構(gòu) 一般有下列兩方面的要求，一方 面要求其分子必須含有相當多的活性官能團，使之能和膠粒表面相結(jié)合；另一方面要求必須具有長鏈的線性結(jié)構(gòu)，以便同時與多個膠粒吸附形成較大的絮團，但相對分子質(zhì)量不能超過一定限度，以使其具有良好的溶解性。 (3)天然有機高分子絮凝劑，如聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨 膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖等。 絮凝效果與絮凝劑的加量、相對分子質(zhì)量和類型、溶液的 pH、攪拌轉(zhuǎn)速和時間等因素有關(guān)。如圖 3－ 1 所示為α 淀粉酶發(fā)酵液中，絮凝劑添加量對絮凝液濾速的影響。首先加入電解質(zhì)，使懸浮粒子間的雙電層電位降低、脫穩(wěn)，凝聚成微粒，然后再加入絮凝劑絮凝成較大的顆粒。這是因為使用助濾劑后， 懸浮液中大量的細微膠體離子被吸附到助濾劑的表面上 ，從而改變了濾餅結(jié)構(gòu)，它的 可壓縮性下降 了，過濾阻力降低了。除此之外，選擇和使用助濾劑的要點如下： (1) 根據(jù)目的產(chǎn)物選擇助濾劑品種 (2) 根據(jù)過濾介質(zhì)和過濾情況選擇助濾劑品種 (3) 粒度選擇 (4) 使用量的選擇 五、加入反應(yīng)劑 加入某些不影響目的產(chǎn)物的反應(yīng)劑，可消除發(fā)酵液中某些雜質(zhì)對過 濾的影響，從而提高過濾速率。 又如環(huán)絲氨酸發(fā)酵液用氧化鈣和磷酸處理，生成磷酸鈣沉淀，能使懸浮物凝固，多余的磷酸根離子還能除去鈣、鎂 5 離子，并且在發(fā)酵液中不會引入其他陽離子，以免影響環(huán)絲氨酸的離子交換吸附。 3． 什么是等電點 ？ 等電點沉淀法 ? 對于氨基酸、蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)，在酸性條件下帶正電荷，在堿性條件下帶負電荷，而在某一 pH 值下，凈電荷為零，稱為等電點。使蛋白質(zhì)變性的方法很多，其中最常用的是加熱法。如在抗生素生產(chǎn)中，常將發(fā)酵液 pH 調(diào)至偏酸性范圍 (pH2～ 3)或較堿性范圍 (pH8～ 9)使蛋白質(zhì)凝固，一般以酸性下除去的蛋白質(zhì)較多。例如在四環(huán)類抗生素中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生 成亞鐵氰化鋅鉀 K2Zn3[Fe(CN6)]2 的膠狀沉淀來吸附蛋白質(zhì)，在生產(chǎn)實際中已取得很好的效果。事實上， 在微生物生長代謝過程中，大多都能產(chǎn)生一定的水解自身細胞壁上聚合物結(jié)構(gòu)的酶，以便使生長繁殖過程進行下去。例如，對谷氨酸生產(chǎn)菌， 6 可加入 ，配成 pH10 的緩沖液，再配 3%的細胞胞懸浮液，加熱至 70℃，保溫攪拌 20min，菌體即自溶。對于破碎前的細胞，可利用顯微鏡或電子微粒計數(shù)器直接計數(shù)。通常將破碎后的細胞懸浮液用離心法分離細胞碎片，測定上清液中目的產(chǎn)物（如蛋白質(zhì)或酶）的含量或活性，并與 100%破碎率所獲得的標準數(shù)值比較，計算其破碎率。由于導(dǎo)電率的大小與微生物種類、處理條件、細胞濃 度、溫度和懸浮液中原電解質(zhì)的含量等有關(guān)，因此，正式測定前應(yīng)預(yù)先采用其他方法制定標準曲線。在實際操作中，可先用化學(xué)法或酶法對細胞進行處理，破壞細胞壁膜的某些物質(zhì)組成，使壁膜的機械強度下降，隨后在用機械法處理，即可大大提高細胞的破碎率。 （ 1）培養(yǎng)過程控制 在發(fā)酵培養(yǎng)過程的細胞生長后期，加入某些能抑 制或組織細胞壁物質(zhì)合成的抑制劑（如青霉素、環(huán)絲氨酸等），繼續(xù)培養(yǎng)一段時間后，新分裂的細胞其細胞壁存在缺陷，利于破碎，而有些胞內(nèi)產(chǎn)物不經(jīng)破碎即可直接滲透出來。收集的包含體用變性劑溶解，再除變性劑即可得到恢復(fù)活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。 與下游過程結(jié)合 7 細胞破碎與固 液分離緊密相關(guān)，對于可溶性產(chǎn)品來講，碎片必須除凈，否則將造成層析柱和超濾膜的堵塞，縮短設(shè)備的壽命。 5．分離出具有活性的蛋白質(zhì) 的 一般步驟 ？ 破碎細胞 分離出包含體 溶解包含體 目標產(chǎn)物的構(gòu)型復(fù)原 6． 什么是 包涵體 ，它存在的兩面性？ 包含體 （ 蛋白質(zhì)產(chǎn)物在胞內(nèi)凝集成沒有活性的固體顆粒 ） 形成的原因比較復(fù)雜，到目前為止還不完全清楚。值得指出的是， 包含體顆粒內(nèi)并不一定都是表達產(chǎn)物 ，也可能含有其他雜質(zhì)，如核酸、脂類、雜蛋白等，主要取決于表達系統(tǒng)。此法很簡單，只需加入大量的水或緩沖液， 缺點 是增大了加工的液量，降低了蛋白質(zhì)的濃度。此法不增加液體體 積，不降低蛋白質(zhì)濃度，但時間較長，易形成蛋白質(zhì)沉淀。 8．從細胞破碎到蛋白質(zhì)復(fù)性的工藝路線？ ①機械破碎（高壓勻漿，高速 珠磨） 離心法提取出包含體 加變性劑溶解 除變性劑復(fù)性； ②機械破碎 膜分離出可溶性蛋白 變性劑溶解包含體 除變性劑復(fù)性； ③化學(xué)破碎（加變性劑） 離心除細胞碎片 除變性劑復(fù)性 路線①的特點是利用了 包含體與細胞碎片的密度差 ，用離心法將包含體與細胞碎片和可溶性蛋白質(zhì)分開，獲得了干凈的包含體，在對包含體溶解復(fù)性。 路線②應(yīng)用了 膜分離技術(shù) ，用微孔膜除去可溶性蛋白質(zhì)，但細胞碎片卻和包含體一起被膜擋住，難以分開；而且膜的堵塞和濃差極化常常導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)的滯留，因此這條路線的 問題較多 。 9． 固 液分離的方法 ？ 離心沉降、微孔膜過濾、雙水相萃取、泡沫分離法、避開固液分離的探索 ——擴張床吸附 10． 離心機的種類 ？過濾的種類？ 8 離心機的種類很多，按其作用原理不同，可分為 過濾式離心機 和 沉降式離心機 兩大類。 碟片式離心機 碟片式離心機是沉降式離心機的一種， 1877 年由瑞典的 DeLaval 發(fā)明，是目前工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的離心機。 按卸料方式的不同，碟片式離心機分為人工卸料、自動間歇排料和噴嘴連續(xù)排料三種型式。 碟片式離心機的分離因數(shù)為 1000～ 20200，適應(yīng)于細菌、酵母菌、放線菌等多種微生物細胞懸浮液及細胞碎片懸浮液的分離。g/18μ ? Ζ＝ 2π n/3g（ r23r13） ctgθ ? 式中 Q——離心機的最大允許進料量 (m3/s) ω ——離心機的角轉(zhuǎn)速度 (rad/s) ? ν ——固體顆粒的自然沉降速率 (m/s) ? Ζ ——與離心機結(jié)構(gòu)有關(guān)的常數(shù) ? d——顆粒直徑 (m) ρ s——固體密度 (kg/m3) ρ L——液體密度 (kg/m3) μ ——液體粘度 (Pa但由于管式離心機的轉(zhuǎn)鼓直徑較小，容量有限，因而生產(chǎn)能力較小。 管式離心機由轉(zhuǎn)鼓、分離盤、 機殼、機架、傳動裝置等組成，如圖 33 及圖 34 所示。 管式離心機設(shè)備簡單，操作穩(wěn)定，分離效率高。具有操作連續(xù)、適應(yīng)性強、應(yīng)用范圍廣、結(jié)構(gòu)緊湊和維修方便等優(yōu)點，特別適合于含固形物較多的懸浮液的分離。如圖 3－ 5所示為并流 型傾析式離心機工作原理圖，懸浮液從進料管徑進料口進入高速旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)鼓內(nèi)，在離心力作用下，固體顆粒發(fā)生沉降分離，沉積在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)壁上。用于酒精廢糟處理時，離心分離后固形物中干固物濃度為 20％～ 30％，液相中懸浮物含量為 ％左右。 當懸浮液通過濾層時，固體顆粒被阻攔或吸附在濾層的顆粒上，使濾液得以澄清，這種方法叫做澄清過濾。 當懸浮液通過濾布時，固體顆粒被濾布所阻攔而逐漸形成濾餅 (或稱濾渣 )。 濾餅過濾按推動力的不同可以分為四種，即 重力過濾、加壓過濾、真空過濾和離心過濾 。與其他設(shè)備比較，板框過濾機的 優(yōu)點 是：結(jié)構(gòu)簡單，裝配緊湊，過濾面積大；過濾的推動力 (壓力差 )能大幅度調(diào)整，并能耐受較高的壓力差，因而固相含水分低，并能適應(yīng)不同過濾特性的發(fā)酵液的過濾；輔助設(shè)備少、維修方便、價格低和動力消耗少等。 真空轉(zhuǎn)鼓過濾機 對于 大規(guī)模生物工業(yè)生產(chǎn) ，真空轉(zhuǎn)鼓過濾機是常用的過濾設(shè)備之一。 如圖 3－ 6 所示為真空轉(zhuǎn)鼓過濾機的工作原理圖。 當轉(zhuǎn)鼓繼續(xù)轉(zhuǎn)動，生成的濾餅依次被洗滌、吸干 (洗滌吸干區(qū) )和刮下卸除 (卸渣區(qū) )。前者可提高過濾速率，后者可提高濾液的澄清度。硅藻土不規(guī)則粒子間形成許多曲折的毛細孔道，藉篩分和吸附作用除去懸浮液中的固體粒子。 按支撐單元的不同，硅藻土過濾機可分為 板框式過濾機、葉片式過濾機和柱式過濾機 三種。相對應(yīng)的有中性膜。 在滲透實驗裝置的膜兩側(cè)制造一個壓力差，并使其大于滲透壓，就會發(fā)生溶劑倒流，使得濃度較高的溶液進一步濃縮，這一現(xiàn)象叫做 反滲透。 4．膜的濃差極化 與膜污染 ？ 如何控制膜污染？ 濃差極化是指在分離過程中，料液中的溶劑在壓力驅(qū)動下透過膜， 溶質(zhì)被截留 ，于是