【正文】 融合基因，產(chǎn)生融合蛋白；②利用大腸桿菌的信號肽或某些真核多肽中自身的信號肽，把真核基因產(chǎn)物搬動到胞漿周質(zhì)的空隙中；③采用位點特異性突變的方法，改變真核蛋白質(zhì)中二硫鍵的位置，從而增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性；④采用蛋白酶缺陷型大腸桿菌，有可能減弱表達產(chǎn)物的降解。⑷應具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當誘導時才能進行轉(zhuǎn)錄。 特點：①具有復制子②有單一限制內(nèi)切酶切位點或多克隆位點③有選擇性遺傳標記如抗藥基因④拷貝數(shù)高⑤生物安全性好 ⒈按復制型式①嚴緊型 ②松弛型 ⒉按基因轉(zhuǎn)移性①傳遞性質(zhì)粒 ②非傳遞性質(zhì)粒 ⒊按遺傳性狀產(chǎn)物分類:①抗生素抗性②限制酶、修飾酶系統(tǒng)⑴載體能夠獨立復制。 基因工程載體分為：克隆載體,轉(zhuǎn)錄載體,表達載體。目的基因的表達產(chǎn)量高。⒉遺傳密碼的簡并使選擇密碼子困難，用氨基酸順序推測核苷酸序列，得到的結(jié)果可能與天然基因不完全一致，易造成中性突變。必須知道目的基因的核苷酸順序或目的蛋白質(zhì)的氨基酸順序。 ，擴大藥物篩選來源。（如胰島素、干擾素、細胞因子等），為臨床使用建立有效的保障。(1)分為三個階段：①起始②延長③終止(2)翻譯后的肽鏈加工:①羥基化②糖基化③磷酸化④乙?；? 醫(yī)用活性蛋白和多肽類包括：①免役性蛋白，如各種抗原和單克隆抗體。特性：①基因可自我復制，②基因決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，③基因可突變。具有速度快、靈敏度高、特異性強的特點。⑦闡明生物體基因組及其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能是當今生命科學發(fā)展的一個主流方向，⑧基因治療取得重大進展，有可能革新整個疾病的預防和治療領域。②新技術、新方法一經(jīng)產(chǎn)生便迅速地通過商業(yè)渠道出售專項技術，并在市場上加以應用。③基因工程藥物和疫苗的研究和開發(fā)突發(fā)猛進。⑨蛋白質(zhì)工程是基因工程的發(fā)展，它將分子生物學、結(jié)構(gòu)生物學、計算機技術結(jié)合起來，形成一門高度綜合的學科。對于許多傳染性疾病來說，預防比治療更重要。 基因按功能分為：①結(jié)構(gòu)基因 ②調(diào)控基因 DNA的結(jié)構(gòu)與性能⒈DNA的結(jié)構(gòu)：四種核苷酸（A T C G）連接一級結(jié)構(gòu)、DNA二級結(jié)構(gòu)（α，β），雙螺旋結(jié)構(gòu)。②細胞因子，如各種干擾素、白細胞介素、集落刺激生長因子、表皮生長因子及凝血因子。 ，以便對其生理、生化和結(jié)構(gòu)進行深入的研究，從而擴大這些物質(zhì)的應用范圍。（步驟）⒈目的基因的克?、矘?gòu)建DAN重組體⒊DAN重組體轉(zhuǎn)入宿主菌⒋構(gòu)建工程菌⒌工程菌發(fā)酵⒍表達產(chǎn)物的分離純化⒎產(chǎn)品的檢驗等基因工程藥物制藥的主要程序獲得目的基因→組建重組質(zhì)粒→構(gòu)建工程菌（或細胞）→培養(yǎng)工程菌 →產(chǎn)物分離純化→除菌過濾→半成品檢定→成品檢定→包裝 克隆真核基因常用方法：逆轉(zhuǎn)錄法和化學合成法。再按相應的密碼子推導出DNA的核甘酸序列。⒊費用高。表達產(chǎn)物穩(wěn)定。DNA(克隆載體）→DNA(轉(zhuǎn)錄載體）→RNA→蛋白質(zhì)→（表達載體）：①染色質(zhì)為環(huán)狀雙股DNA分子 ②具有操縱子結(jié)構(gòu) ③結(jié)構(gòu)基因多為單拷貝 ④特定區(qū)域分布特異DNA順序，因此外源DNA分子可以插入原核細胞DNA復制體系的特定區(qū)段：基因克隆載體是一類能夠承載外源基因并將其帶入受體細胞得以穩(wěn)定維持的DNA分子。載體本身是一個復制子，具有復制起點。⑸應具有很強的終止子，只轉(zhuǎn)錄克隆的基因，所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。⑷細胞代謝負荷：⑸工程菌的培養(yǎng)條件：外源基因的高水平表達，不僅涉及宿主、載體和克隆基因三者之間的相互關系，而且與其所處的環(huán)境條件息息相關，必須優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)條件，進一步提高基因表達水平。分批培養(yǎng)中選擇不同的碳源，連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率等都能一定范圍內(nèi)控制菌體的生長，從而控制乙酸的產(chǎn)生，減少它的抑制作用。 ②菌體生長與前體供應的關系 在基礎培養(yǎng)基中加入氨基酸（小分子前體）能使菌體比生長率提高，蛋白合成增加。高拷貝質(zhì)粒的工程菌（240拷貝）中，生長速率和菌體總蛋白合成均減少。分裂不穩(wěn)定：指工程菌分裂時出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象。4．受體細胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進重組分子的缺失重排。采取流加補料法，或加入甘氨酸、甲硫氨酸抑制乙酸生成。③收率要高。：色譜分離方法⑴ 離子交換層析（ IEC）離子交換層析的基本原理是通過帶電的溶質(zhì)分子與離子交換劑中可交換的離子進行交換，從而達到分離的目的。疏水層析的原理與反相色譜的原理相似，主要是利用蛋白質(zhì)分子表面上的疏水區(qū)域和介質(zhì)中的疏水基團之間的相互作用，無機鹽的存在能使相互作用力增強。配基：在親和層析中起可逆性結(jié)合的特異性物質(zhì)。主要應用兩個方面：①脫鹽和更換緩沖液②蛋白質(zhì)分子的分級分離。兩種形態(tài)： 成纖維細胞型（來源于中胚層組織的細胞）；上皮細胞型（來源于內(nèi)、外胚層組織的細胞）⒉懸浮細胞生長不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長。（⒊）正常二倍體細胞的生長壽命是有限的。缺點:培養(yǎng)條件高、成本貴、產(chǎn)量低，安全性問題。它適用于一切種類的非貼壁依賴性細胞（懸浮細胞），也適用于兼性貼壁細胞。優(yōu)點是適用的細胞種類廣，較容易采用灌流培養(yǎng)的方式使細胞達到高密度；缺點是操作比較麻煩，需要合適的貼附材料和足夠的面積，培養(yǎng)條件不均一，傳質(zhì)和傳氧較差。（107～108個/mL）產(chǎn)量高。多數(shù)抗原物為混合物須經(jīng)免疫、篩選、克隆化。對鼠源性的單抗進行基因加工和改造。放射性核素標記的抗體對腫瘤細胞殺傷較大。（antibody directed enzyme prodrug therapy,ADEPT）關鍵是選擇適當?shù)幕罨福八帉Α? 第三代免疫毒素：重組免疫毒素用基因克隆方法改造毒素基因和小分子抗體基因重組表達。 ：植物無菌培養(yǎng)：（1）幼苗及植株的培養(yǎng)（2）愈傷組織培養(yǎng)（外植體，細胞聚集體）（3）懸浮培養(yǎng)（單細胞或小細胞團的液體培養(yǎng)）（4）器官培養(yǎng)（5）胚胎培養(yǎng) 初級代謝產(chǎn)物：核酸、蛋白質(zhì)、糖類外植體 (脫分化)→愈傷組織（再分化）→生長點（形態(tài)發(fā)生）→芽、根→小植株:：生物堿、黃酮類、萜類、有機酸、木質(zhì)素、皂苷類、多元酚類 次級代謝作用是由特異蛋白質(zhì)調(diào)控產(chǎn)生的內(nèi)源化合物的合成、代謝及分解作用的綜合過程。優(yōu)點：易于控制溫度、 pH、溶氧及營養(yǎng)物質(zhì)濃度，混合均勻。優(yōu)點：低剪切力，較好的混合，較高的氧傳遞效果。缺點：放大困難，大規(guī)模操作困難。更換培養(yǎng)基帶走代謝物。Ⅱ 細胞株系建立：建立懸浮細胞繁殖體系（液體培養(yǎng)）。①供氧能力及氣泡分散程度 ②剪切力大小及對細胞的影響③高密度培養(yǎng)時培養(yǎng)液的混合程度 ④溫度、pH及營養(yǎng)物質(zhì)的控制能力 ⑤細胞團大小的控制能力⑥易于放大：①誘導子在植物細胞工程研究中的應用 ②前體飼喂 ③兩相法培養(yǎng) ④轉(zhuǎn)基因技術在次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)中的應用 ⑤植物生物轉(zhuǎn)化技術與生物制藥 酶是由活細胞產(chǎn)生的具有特殊催化功能的一類蛋白質(zhì)。③反應條件易控制，可實現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應的連續(xù)化和自動控制。②初始投資較大。 方法：①載體結(jié)合法、②交聯(lián)發(fā)、③包埋法、④選擇性熱變性法 制備：⑴吸附法制備固定化酶技術⑵包埋法制備固定化酶技術①界面沉降法②界面聚合法⑶交聯(lián)法制備固定化酶技術⑷共價結(jié)合法制備固定化酶技術，生物催化劑功能，固相催化劑特點。⒋流化床反應器：底物以足夠大的流速向上通過固定化酶床層，使固體顆粒處于流化狀態(tài)，達到混合的目的。⒎其它反應器： 概念：人造的具有酶性質(zhì)的催化劑（分子模擬立體結(jié)構(gòu)，化學結(jié)構(gòu)）特點：相對結(jié)構(gòu)簡單，高效，高催化性，蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì) 分類：： ：：： 制備過程：，：創(chuàng)造天然酶不具備的優(yōu)良特性，擴大應用領域。（4）固定化修飾。⑴熱穩(wěn)定性提高 ⑵抗各類失活因子能力提高 ⑶抗原性消除 ⑷體內(nèi)半衰期延長： ⑸最適pH改變 ⑹酶學性質(zhì)變化 ⑺對組織分布能力改變 。（4）化學修飾法可以在酶結(jié)構(gòu)與功能的研究方面提供信息，但是還不 夠準確和系統(tǒng)。68. ：（1）增加疏水性底物或產(chǎn)物的溶解性。（5）容易從低沸點的溶劑中分離純化產(chǎn)物。（9）固定化酶方法簡單，可以只沉積在載體表面。（2）酶選擇性：對固定的底物有些酶選擇性會因所處的溶劑不同而變化。 ：生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)和選育（菌種）培養(yǎng)基制備（培養(yǎng)基）發(fā)酵條件的優(yōu)化與控制（攪拌通氣，溶氧，發(fā)酵過程參數(shù)控制，反應器的設計）產(chǎn)物的分離、提取與精制等（純化）菌種→工藝→設備 一、菌種選育的物質(zhì)基礎 ：DNA二、自然選育：自發(fā)突變（正負） 三、誘變育種 ：人工誘變 四、原生質(zhì)體融合：細胞融合，基因重組 （一）（1）微小損傷突變：堿基置換，碼組移動（2）染色體畸變：易位，逆位，缺失，重復（3）染色體組突變：數(shù)目變化（單倍體變多倍體）：物理誘變劑，化學誘變劑，生物誘變劑 （二）：耐受自身分泌的抗生素，：，而需要添加一些物質(zhì)（氨基酸、核苷酸等）才能生長的突變體。 誘變包括：出發(fā)菌株的選擇→誘變劑種類和誘變劑劑量的選擇→ 合理的使用方法 篩選包括：初篩→重復篩選→突變株性能檢測→直到獲得新的優(yōu)良菌株。 二、補料分批發(fā)酵 ：補加新鮮培養(yǎng)基。一、培養(yǎng)基的影響及其控制二、溫度的影響及其控制三、溶氧的影響及其控制四、pH的影響及其控制①培養(yǎng)基的影響及其控制：糖類，脂肪，有機酸，碳氫化合物（速效碳源葡萄糖；遲效碳源淀粉，乳糖）：無機氮源，有機氮源（速效氮源氨基酸，玉米漿；遲效氮源黃豆餅粉，花生餅粉、棉籽餅粉）。（2）氮源①構(gòu)成細胞物質(zhì) ②構(gòu)成產(chǎn)物。如土霉素，四環(huán)素，金霉素優(yōu)點：設備簡單，節(jié)省溶劑，收率高缺點：過濾較困難 三、溶劑萃取法 ：改變pH，改變?nèi)軇?，改變?nèi)芙舛取? 產(chǎn)生雜合抗生素（1）生物合成途徑中某個酶基因突變（2）引入一個酶基因（3）利用底物特異性不強的酶催化形成新產(chǎn)物 組合生物合成:微生物次級代謝產(chǎn)物合成是多酶體系參與的，特點是：（