【正文】 倍鏡觀察，然后換用高倍鏡觀察酵母菌的形態(tài)和出芽情況，同時可以根據(jù)是否染上顏色來區(qū)別死、活細胞。然后按無菌操作法取在瓊脂斜面上培養(yǎng)48小時的酵母菌少許，放在呂氏堿性美藍染液中，使菌體與染液均勻混合。使細胞內(nèi)具有較強的還原能力，能使美藍從藍色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型，所以酵母的活細胞無色，而對于死細胞或代謝緩慢的老細胞，則因它們無此還原能力或還原能力極弱，而被美藍染成藍色或淡藍色。二、基本原理酵母菌是多形的、不運動的單細胞微生物，細胞核與細胞質(zhì)已有明顯的分化，菌體比細菌大。（4）置于28℃溫室培養(yǎng)48小時后，取出培養(yǎng)皿，打開皿蓋，用鑷子將玻璃紙與培養(yǎng)基分開，再用剪刀取一小片玻璃紙置載玻片上，用顯微鏡觀察。（4）在培養(yǎng)皿的濾紙上，加無菌的20%甘油數(shù)毫升，至濾紙濕潤即可停加，將培養(yǎng)皿置28℃培養(yǎng)一定時間后，取出載玻片置顯微鏡下觀察。置顯微鏡下先用低倍鏡觀察，必要時再換高倍鏡。霉菌的菌絲、分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)常作為分類的重要依據(jù)。五、實驗報告。然后用小刀切取放線菌培養(yǎng)體一塊（帶培養(yǎng)基切下）。（1）將培養(yǎng)3—4天的放線菌培養(yǎng)皿打開，放在顯微鏡低倍鏡下尋找菌落的邊緣，直接觀察氣生菌絲和孢子絲的形態(tài)，注意其分枝情況、卷曲情況等。（1）將高氏1號培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿，制成4㎜左右的培養(yǎng)基平板，經(jīng)培養(yǎng)檢驗后無菌，備用。（1）用接種鏟連同培養(yǎng)基挑取放線菌菌苔置載玻片中央。（6）將載玻片置顯微鏡下觀察。（3）將一定量的無菌水倒入裝有土樣的無菌玻璃珠瓶中，制成菌懸液，再適當稀釋。氣生菌絲及孢子的形狀和顏色常作為分類的重要依據(jù)。放線菌是由不同長短的纖細的菌絲所形成的單細胞菌絲體。同時把聚光鏡降下，以免接物鏡與聚光鏡發(fā)生碰撞，反光鏡垂直于鏡座。將物鏡鏡頭轉(zhuǎn)開，取下玻片，用擦鏡紙拭去鏡頭上的油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用干凈擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。 ?。?）從接目鏡內(nèi)觀察，進一步調(diào)節(jié)光線，使光線明亮，再用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升，直至視野出現(xiàn)物像為止，然后用細調(diào)節(jié)器校正焦距。找到最適宜觀察的部位后，將此部位移至視野中心，準備用油鏡觀察。2．低倍鏡觀察檢查的標本需先用低倍鏡觀察，因為低倍鏡視野較大，易發(fā)現(xiàn)目標和確定檢查的位置。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　七、實驗報告、高倍鏡和油鏡下觀察到的細菌個體形態(tài)。也可以用顯微鏡外加輕便熒光光源代替熒光顯微鏡，其觀察原理相同，只是觀察效果略差。這2塊棱鏡中的一塊固定，另一塊可以旋轉(zhuǎn)（或者2塊均可旋轉(zhuǎn)），并注有刻度。它的成像特點是：黑暗的視野中可見明亮的被檢物體的明細外貌及其運動，但是看不見被檢物體內(nèi)部的細微結(jié)構(gòu)。合軸望遠鏡是用在相差顯微鏡上調(diào)節(jié)光軸的輔助設(shè)備，它不能用來觀察被檢標本。環(huán)狀光闌的作用是形成一個空心的光線錐，造成透過標本的光線分離成直射光和衍射光2組光線。6．顯微鏡放在干燥處，鏡箱內(nèi)要放硅膠吸收潮氣。3．透鏡要用擦鏡紙擦拭，若僅用擦鏡紙擦不凈，可用擦鏡紙蘸二甲苯拭擦，但用量不宜過多，拭擦時間也不宜過長，以免粘合透鏡的樹脂被溶化，而使透鏡膠落。因此，對顯微鏡要妥善保管。（8）復原　顯微鏡使用完畢，關(guān)閉電源，將物鏡鏡頭轉(zhuǎn)開，取下玻片。如果鏡頭已提出香柏油而尚未見到物像時，應(yīng)按上述過程重復操作。（7）油鏡觀察　轉(zhuǎn)動粗調(diào)焦螺旋，使物鏡與鏡臺保持一定距離。適當調(diào)節(jié)亮度后，只需微微轉(zhuǎn)動細調(diào)焦螺旋，就可看到更清晰的物像。（5）低倍鏡觀察　用粗調(diào)焦螺旋調(diào)焦后，再輕輕轉(zhuǎn)動細調(diào)焦螺旋，以便得到清晰的物像。在鏡檢全過程中，根據(jù)所需光線的強弱，還可通過擴大或縮小光圈、升降聚光器加以調(diào)節(jié)。（2）檢查　檢查各部件是否完好，鏡身、鏡頭必須清潔。如只需某一波長的光線時，就要用濾光片。調(diào)節(jié)聚光鏡的高度和虹彩光圈的大小，可得到適當?shù)墓庹蘸颓逦膱D像。目鏡的放大倍數(shù)過大，反而影響觀察效果。其中“NA ”表示數(shù)值孔徑（numerical　aperture,簡寫為NA），“10”表示放大倍數(shù)，“160/”分別表示鏡筒長度和所需蓋玻片厚度（㎜），“16㎜”表示焦距。2．光學系統(tǒng)物鏡（objective）物鏡安裝在鏡筒下端的轉(zhuǎn)換器上，因接近被觀察的物體，故又稱接物鏡。載物臺(stage)又稱鏡臺，為方形或圓形的盤，用以載放被檢物體，中心有一個通光孔。鏡筒有單筒和雙筒兩種，單筒又可分為直立式和后傾式兩種。1．機械裝置鏡座(base)和鏡臂(arm)鏡座位于顯微鏡底部,呈馬蹄形，它支持全鏡。第一部分 基礎(chǔ)實驗實驗一 顯微鏡的基本構(gòu)造、使用和保養(yǎng)一、目的要求。鏡臂有固定式和活動式兩種，活動式的鏡臂可改變角度。而雙筒則都是傾斜式的，傾斜式鏡筒傾斜45176。在載物臺上有的裝有兩個金屬壓夾稱標本夾，用以固定標本；有的裝有標本推動器，將標本固定后，能向前后左右推動。其作用是將物體作第一次放大，是決定成像質(zhì)量和分辨能力的重要部件。目鏡（coular lens）裝于鏡筒上端，由兩塊透鏡組成。聚光器（condenser）光源射出的光線通過聚光器匯聚成光錐照射標本，增強明度和造成適宜的光錐角度，提高物鏡的分辨力。光源（light source）較新式的顯微鏡其光源通常是安裝在顯微鏡的鏡座內(nèi)，通過按扭開關(guān)來控制；老式的顯微鏡大多是采用附著在鏡臂上的反光鏡，反光鏡是一個兩面鏡子，一面是平面，另一面是凹面。選用適當?shù)臑V光片，可以提高分辨力，增加影像的反差和清晰度。（3）對光　配置內(nèi)置式電光源的顯微鏡可直接打開電源開關(guān)，并調(diào)節(jié)光量，使視野內(nèi)的亮度達到明暗適宜，同時打開光圈。（4）調(diào)焦　光線對好后，將玻片標本放在鏡臺上，有蓋玻片的一面朝上，被檢物體對準鏡臺孔正中，用標本移動器上的壓片夾卡緊，然后調(diào)焦。如果觀察的目標不在視野中央，可調(diào)節(jié)標本移動器，使之恰好位于視野中央。切記此時不能使用粗調(diào)焦螺旋，由于顯微鏡下觀察的被檢物有一定厚度，故在觀察過程中必須隨時轉(zhuǎn)動細調(diào)焦螺旋，以了解被檢物不同光學平面的情況。滴1滴香柏油于玻片標本待觀察的區(qū)域上，將油鏡頭轉(zhuǎn)至工作位置，眼睛從側(cè)面注視，轉(zhuǎn)動粗調(diào)焦螺旋，直至油鏡頭浸沒于香柏油內(nèi)，幾乎與載玻片相接觸，但不能相碰。使用完畢，將鏡頭從香柏油中脫離，取下玻片，用擦鏡紙擦去鏡頭和玻片上的香柏油，再用擦鏡紙蘸少許二甲苯擦拭鏡頭上的油跡，然后用干凈擦鏡紙擦去鏡頭上殘留的二甲苯。擦凈載物臺和物鏡，將各部分還原，注意物鏡頭不可正對鏡臺孔，裝鏡入箱。1．避免直接在陽光下曝曬，因為透鏡與透鏡之間，透鏡與金屬之間都是用樹脂或亞麻油仁粘合起來的。4．不能隨意拆卸顯微鏡，尤其是物鏡、目鏡、鏡筒不能隨意拆卸，因拆卸后空氣中的灰塵落入里面引起生霉。目鏡、物鏡放在盒內(nèi)并存于干燥器中，以免受潮生霉。這2組光線分別從相板上的環(huán)區(qū)和環(huán)外區(qū)通過，導致它們之間微弱的相位差人為地擴大增強，進而在上面透鏡的收斂作用下，這2組光線復在一條光路上發(fā)生干涉效應(yīng)，使得相位差轉(zhuǎn)變成振幅差（即明暗差），反差增強。相差顯微鏡主要用于觀察未染色的活細胞，亦可用于觀察固定過的材料?！L之間。另外，偏振光顯微鏡的鏡臺亦能旋轉(zhuǎn)。熒光顯微鏡主要用于觀察材料中熒光染料著色的色素顆粒等特殊成分。，應(yīng)將鏡筒徐徐上升還是下降？為什么？，為什么要在載玻片上滴加香柏油？，為什么要先用低倍物鏡觀察，而不是直接用高倍物鏡或油鏡觀察？實驗二 細菌個體形態(tài)的觀察一、目的要求1．學習觀察細菌的個體形態(tài)2．學會生物圖的繪制二、基本原理細菌的個體形態(tài)是指細菌細胞的大小，形狀等特征，利用觀察個體形態(tài)對細菌進行初步識別和鑒定。將三型涂片玻片標本置鏡臺上，用標本夾夾住，移動推動器，使觀察對象處在物鏡正下方，轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器，㎝處，由目鏡觀察，此時可適當?shù)乜s小光圈，否則視野中只見光亮一片，難見到目的物，同時用粗調(diào)節(jié)器慢慢升起鏡筒，直至物像出現(xiàn)后再用細調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)到物像清楚時為止，然后移動標本，認真觀察標本各部位，找到合適的目的物，并將其移至視野中心，準備用高倍鏡觀察。（1）用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒提起約2㎝，將油鏡轉(zhuǎn)至正下方。如油鏡已離開油面而仍未見物像，必須再從側(cè)面觀察，將油鏡降下，重復操作至物像看清為止。切忌用手或其他紙擦鏡頭，以免損壞鏡頭。五、實驗報告？分別是？、高倍鏡和油鏡下觀察到的細菌形態(tài)圖。菌絲體分為兩部分，即潛入培養(yǎng)基中的營養(yǎng)菌絲（或稱基內(nèi)菌絲）和生長在培養(yǎng)基表面的氣生菌絲。三、器材顯微鏡，載玻片，蓋玻片，玻璃棒，接種鏟，小刀，鑷子，土樣，石炭酸復紅染液，呂氏堿性美藍染液，加拿大樹膠，玻璃紙，高氏1號培養(yǎng)基；培養(yǎng)皿等。（4），接種在玻璃紙上，并用無菌玻璃棒涂勻后，置28℃培養(yǎng)，直至菌長好，備用。附：玻璃紙滅菌方法：在玻璃紙滅菌時，若直接將干燥的玻璃紙滅菌，它就會縮小，不便使用。（2）用另一載玻片將其壓碎，棄去培養(yǎng)基，制成涂片，干燥、固定。（2）用火焰滅菌的鑷子將無菌蓋玻片以45度傾斜角插入平皿培養(yǎng)基瓊脂內(nèi)，然后將孢子懸液（濃度以稀釋102—103為好），接種在蓋玻片與平皿培養(yǎng)基的界面上。（2）取清潔的蓋玻片一塊，在菌落上面輕輕按壓一下，然后將印有痕跡的一面朝下放在有一滴呂氏堿性美藍染液的載玻片上，將孢子等印浸在染液中，制成印片。將培養(yǎng)體表面貼在涂有樹膠的玻片上，用另一玻片輕輕按壓（不要壓碎），然后將放線菌培養(yǎng)體小心棄去，注意不要使培養(yǎng)體在玻片上滑動，否則印痕模糊不清。？實驗四　霉菌的個體形態(tài)觀察一、目的要求掌握觀察霉菌形態(tài)的基本方法，并觀察其形態(tài)特征。三、器材曲霉（Aspergillus sp.），青霉 (Penicillium sp.)，根霉(Rhizopus sp.)，毛霉(Mucor sp.)；乳酸石炭酸棉藍染色液，20%甘油，馬丁氏（Martin）培養(yǎng)基平板或查氏培養(yǎng)基平板，無菌吸管，載玻片，蓋玻片，U形棒，解剖刀，玻璃紙，濾紙等。2．載玻片觀察法（1）將略小于培養(yǎng)皿底內(nèi)徑的濾紙放入皿內(nèi)，再放上U形玻棒，其上放一潔凈的載玻片，然后將二個蓋玻片分別斜立在載玻片的兩端，蓋上皿蓋，把數(shù)套（根據(jù)需要而定）如此裝置的培養(yǎng)皿疊起，包扎好，㎏/㎝2，℃滅菌20分鐘，備用。（1）向霉菌斜面試管中加入5ml無菌水，洗下孢子，制成孢子懸液。五、實驗報告。繁殖方式也較復雜，無性繁殖主要是出芽生殖，僅裂殖酵母屬是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通過接合產(chǎn)生子囊孢子。因此，用美藍水浸片不僅可觀察酵母的形態(tài)，還可以區(qū)分死、活細胞。2．用鑷子夾蓋玻片一塊，小心地蓋在液滴上。4．染色半小時后，再觀察一下死細胞數(shù)是否增加。2．借助顯微鏡觀察藻類個體形態(tài)，通過實驗了解藻類的特征，細胞等的構(gòu)成，是藻類分類的重要依據(jù)。3．高倍鏡觀察　用低倍鏡調(diào)準焦距后，換高倍鏡，若有點模糊，用細調(diào)節(jié)器調(diào)至清晰。通常有卵圓形、橢圓形、杯形、雙錐形及多角形等等。內(nèi)外質(zhì)分界明顯，外質(zhì)透明，內(nèi)質(zhì)泡狀或顆粒狀。（3）纖毛蟲（Ciliata）：纖毛蟲是原生動物中進化到高一級的類群，在結(jié)構(gòu)上比較復雜。①自由游動的纖毛蟲：游泳時常匍匐爬行在雜質(zhì)中，常見的有斜管蟲（Chilodonella）、漫游蟲（Litonotus）、前管蟲（Prorodon）、腎形蟲（Colpoda）、草履蟲（Paramecium）等。常見種類有肋楯纖蟲（Aspidisca costata）、尖毛蟲（Oxytricha）、棘尾蟲（Stylonychia）、瘦尾蟲（Uroleptus）等。2．鞏固顯微鏡的使用方法。堿性染料并不是堿，和其他染料一樣是一種鹽，電離時染料離子帶正電，易與帶負電荷的細菌結(jié)合而使細菌著色。三、器材顯微鏡，酒精燈，載玻片，接種環(huán)，雙層瓶，擦鏡紙，生理鹽水，玻璃鉛筆，吸水紙，試管架，火柴，小燒杯，酒精瓶等；　呂氏堿性染色液，石炭酸復紅染色液；金黃色葡萄球菌菌種，枯草芽孢桿菌菌種。3．固定 涂片面向上，于火焰上通過2—3次，使細胞質(zhì)凝固，以固定細菌的形態(tài)，并使其不易脫落。5．水洗 染色時間到后，用自來水沖洗，直至沖下之水無色時為止。五、實驗報告1．繪出你所觀察到的經(jīng)單染色的兩種細菌形態(tài)圖。二、基本原理革蘭氏染色反應(yīng)是細菌分類和鑒定的重要性狀。革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要是由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成的，在染色過程中，當用乙醇處理時由于脫水而引起網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的孔徑變小，通透性降低，使結(jié)晶紫碘復合物被保留在細胞內(nèi)而不易脫色，因此，呈現(xiàn)藍紫色；革蘭氏陰性細菌的細胞壁中肽聚糖含量低，而脂類物質(zhì)含量高，當用乙醇處理時，脂類物質(zhì)溶解，細胞壁的通透性增加，使結(jié)晶紫碘復合物易被乙醇抽出而脫色，然后又被染上了復染液（番紅）的顏色，因此呈現(xiàn)紅色。脫色劑是將被染色的細胞進行脫色，不同類型的細胞脫色反應(yīng)不同，有的能被脫色，有的則不能，脫色劑常用95%的酒精（ethanol）。2．涂片　本實驗采用“三區(qū)”涂片法。（注意涂片不可過于濃厚）4．染色（1）初染 加草酸銨結(jié)晶紫一滴，約一分鐘，水洗。（5）鏡檢 干燥后，置油鏡觀察。此外，菌齡也影響染色結(jié)果，如陽性菌培養(yǎng)時間過長，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反應(yīng)。二、基本原理利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)，是一種常用的微生物計數(shù)方法。由于此法計得的是活菌體和死菌體的總和，故又稱為總菌計數(shù)法。所以無論是哪種規(guī)格的計數(shù)板，每一個大方格中的小方格數(shù)都是相同的。2．鏡檢計數(shù)室在加樣前，先對計數(shù)板的計數(shù)室進行鏡檢。靜置5—10分鐘即可計數(shù)。若選用2516規(guī)格的計數(shù)板則每個計數(shù)室選5個中方格，可選4個角和中央的中格（即80個小格），若選用1625規(guī)格的計數(shù)板，則數(shù)四個角：左上、右上、左下、右下的四個中方格，（即100小格）中的菌體進行計數(shù)。5．清洗血球計數(shù)板使用完畢后，將血球計數(shù)板在水籠頭上用水柱沖洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風機吹干。A表示五個中方格中的總菌數(shù)；B表示菌液稀釋倍數(shù)。用來測量微生物細胞大小的工具有目鏡測微尺（圖3）和鏡臺測微尺（圖4）。圖3 目鏡測微尺A．　目鏡測微尺；A． 旋開接目鏡透鏡，放入目鏡測微尺；B． 將接目鏡插回鏡筒目鏡測微尺（圖3，A）是一塊可放在接目鏡內(nèi)的隔板