引物篇引物合成及各種問(wèn)題總結(jié)-wenkub
2023-04-09 01:47:37 本頁(yè)面
【正文】 是增加樣品比重，容易加樣。超出需要之外的OD數(shù)要求，其實(shí)也是對(duì)社會(huì)資源的一種浪費(fèi)，同時(shí)也從一個(gè)側(cè)面反映了部分研究人員，特別是新手的自信心不足，總覺(jué)得需要重復(fù)多次才能成功。如果是做基因拼接或退火后做連接，1 OD就足夠了。我們合成過(guò)120base的引物，但是產(chǎn)率很低。需要根據(jù)稀釋倍數(shù)換算出母液的OD值。主要用于短鏈和修飾引物的純化?！簟AGE純：PAGE純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對(duì)DNA片段進(jìn)行分離，然后從凝膠中回收目的DNA的方法。對(duì)于需要用于測(cè)序、克隆的引物不能使用這個(gè)級(jí)別。，如何選擇？◆ C18柱脫鹽：有人稱(chēng)其為簡(jiǎn)易反相柱，它對(duì)DNA有特異性的吸附，可以被有機(jī)溶解洗脫，但不會(huì)被水洗脫，所以能有效地去除鹽分。羥基上的保護(hù)基團(tuán)DMT，重復(fù)以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。羥基沒(méi)有參加反應(yīng)(少于2%)，用乙酸酐和1甲基咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)，這種短片段可以在純化時(shí)分離掉。端被活化，539。磷酸二酯鍵連接。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的339。引物篇？目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。端向539。第一步是將預(yù)先連接在固相載體CPG上的活性基團(tuán)被保護(hù)的核苷酸與三氯乙酸反應(yīng)，脫去其539。羥基仍然被DMT保護(hù)，與溶液中游離的539。第四步，在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯。合成過(guò)程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。它不能有效去除比目的片段短的小片段?！簟PC純化： OPC純化是根據(jù)DNA保護(hù)基（DMTr基）和Cartridge柱中樹(shù)脂間的親合力作用的原理進(jìn)行純化目的DNA片段。PAGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法，純化后的DNA純度大于95%，對(duì)長(zhǎng)鏈Oligo DNA (大于50mer)的純化特別有效。該法的弱點(diǎn)是成本較高，批量生產(chǎn)效率不高。？答：引物常用的純化方式C18脫鹽，OPC純化，PAGE純化，HPLC純化。除非需要，建議合成片段長(zhǎng)度不要超過(guò)80mer,按照目前的引物合成效率，80mer的粗產(chǎn)品，全長(zhǎng)（還不一定正確）引物的百分比不會(huì)超過(guò)40%，后續(xù)處理還有丟失很多，最后的產(chǎn)量是很低。但是有些研究人員，就做幾次PCR，但是卻要510 OD。？答：實(shí)驗(yàn)室方便的作法是用PAGE方法。600V電壓進(jìn)行電泳，一定時(shí)間后(約23小時(shí))，剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測(cè)帶型，在主帶之下沒(méi)有雜帶，說(shuō)明純度是好的。 溶解前您需要核對(duì)合成報(bào)告單和引物標(biāo)簽上的引物OD數(shù)是否一致。引物的分子量可以從合成報(bào)告單上獲得。Tm的定義：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its plementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GCrich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.（含修飾）的分子量是如何確定的？答：非修飾的引物的Molecular Weight在隨引物提供的報(bào)告單上都有明確的標(biāo)示。Ns為硫代數(shù)目，硫代每個(gè)位置增加分子量16。？答：引物合成后，經(jīng)過(guò)一系列處理和純化步驟，旋轉(zhuǎn)干燥而成片狀物質(zhì)。修飾熒光引物需要避光保存。或339。磷酸化的產(chǎn)物如果還不能連接載體上，需要檢查載體的酶切效果，需要改善引物退火的條件。我們有一套控制辦法，預(yù)防堿基輸入錯(cuò)誤。引物序列中插入突變往往是堿基重復(fù)，一般認(rèn)為，偶連過(guò)程中，正在偶連的部分單體發(fā)生丟失DMT,導(dǎo)致單體又接了上去，故發(fā)生插入同一堿基的突變。對(duì)于堿基置換的突變，產(chǎn)生的原因一般認(rèn)為是堿基不能100%脫保護(hù)，即引物上可能含有殘留保護(hù)基團(tuán)，引物的這些區(qū)域不能很好地與互補(bǔ)鏈配對(duì)，當(dāng)擴(kuò)增的產(chǎn)品被亞克隆轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，可能被細(xì)菌中修復(fù)系統(tǒng)補(bǔ)上了非配對(duì)的堿基。脫嘌呤的引物在引物后處理脫保護(hù)階段如果被降解，測(cè)序就會(huì)發(fā)現(xiàn)堿基G或A的缺失。研究人員總希望合成的引物萬(wàn)無(wú)一失，這種心情可以理解。，該如何處理？答：對(duì)您遇到的困惑，我們表示同情。一般情況下，每個(gè)克隆突變的位點(diǎn)都不一樣，提示正確的總是有的，就是如何找到它。但是制備PAGE電泳，上樣量都是非常大，電泳時(shí)的條帶非常寬，帶與帶之間有重疊，分辨率已下降，電泳后割帶回收目的引物時(shí)，
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