westernblot問題匯總-wenkub
2023-04-08 05:08:38 本頁面
【正文】 喜歡在緩沖液中涮上樣針，導(dǎo)致緩沖液污染 ）。本人在看過回帖后，結(jié)合自己的試驗(yàn)，重新設(shè)計(jì)了方案，得到了滿意的結(jié)果，同時感覺有必要拿來和大家分享：1）蛋白電泳中出現(xiàn)的縱向條帶：原因主要是由于電泳樣品或是電極緩沖液中有沒有溶解的樣品顆粒所致，上樣前充分將樣品離心，或重新使用新配電極緩沖液即可解決。無論哪個無效都不能發(fā)光，因此預(yù)實(shí)驗(yàn)一定要從最低的稀釋度開始，以排除抗體的因素5)ECL試劑盒質(zhì)量的問題，不可小覷。如果背景強(qiáng)于條帶，那么肯定是前面默默個原因的一種，這是可以將膜在TBST中漂洗以下再發(fā)光，有時會有比較好的效果（僅限于國外較好的試劑盒，國產(chǎn)的不行，洗一下啥也沒了?。┻@個時候可以洗膜，洗膜后重新發(fā)光。4）抗體濃度太高，或孵育時間太常都可能遇到這種情況。如果你覺得不夠可以加點(diǎn)BSA,1%吧。轉(zhuǎn)膜緩沖液過熱：緩沖液離子強(qiáng)度太低，或電壓及電流過高。：轉(zhuǎn)膜時在膜與膠之間有氣泡。、或漂移 因?yàn)檗D(zhuǎn)膜儀使用時間太長，兩塊板之間的海綿由于長期使用變得很薄。當(dāng)按照陰極海棉濾紙膠膜濾紙海綿依次放好后兩塊板不能壓緊，因而在膠和膜之間可能存在潛在的間隙，電轉(zhuǎn)移時蛋白從膠和膜之間的空隙中流走，形成如圖所示的形狀。做三明治時一定要逐層壓緊，趕盡氣泡。按照上述方式配液，同時轉(zhuǎn)膜過程中注意降溫。2）一抗或者是封閉液與膜蛋白的交叉反應(yīng)。那么可以適當(dāng)降低一抗二抗的濃度，或是用提高溫度的方式來代替雜交時間的延長；另外，少量多次得洗膜效果要優(yōu)于多量而長時間得洗膜效果。沒有信號：1)用單抗時比較容易出現(xiàn)這種情況。偶親身經(jīng)歷。2）電泳條帶前沿在染色脫色后呈尖形。 ?1）一般跟你的分離膠的濃度有關(guān)。所以WESTERN BLOTTING 做不出來了。，最下端的蛋白條帶很清楚，可是上邊啥都沒有看見，社么原因？1)可能是時間不夠，因?yàn)橐话闶欠肿恿啃〉南绒D(zhuǎn)上去的，大的后轉(zhuǎn)，看你的目的蛋白了，如小的話，最后不要太長時間 2)轉(zhuǎn)膜的時間要根據(jù)你的目標(biāo)蛋白大小和膠濃度而定。 WB的關(guān)鍵點(diǎn)我覺得有一下幾個：一是樣品的處理；二是電泳和轉(zhuǎn)膜條件的摸索；三是保證試劑、抗體的質(zhì)量。要求目的蛋白和內(nèi)參蛋白大小有一定的差異。真正的十二烷基磺酸鈉不能用于WESTERN。2）關(guān)鍵是找一塊很平的桌面，使兩塊玻璃底面非常齊就行了4）注意兩邊均勻用力，一般不會再漏。但是如果你放了墊片再對齊玻片底部，或者在桌子上對其玻片底部然后放到架子上的話，經(jīng)常會漏膠？1）可能因?yàn)槟z凝的不均勻，聚合的不是很好，灌膠的時候盡量混勻2）是不是有窄有寬？可能與你拔梳子的時候有關(guān)，拔梳應(yīng)該迅速，沖洗加樣孔的時候要小心，以免把上樣帶扭曲；膠配好了用槍吹幾下再灌膠，還有就是要等指示劑跑到兩層膠交界成一線時，再調(diào)高電壓。3）樣品中鹽濃度過高？點(diǎn)樣量太多或每孔點(diǎn)樣量不均勻？電泳電壓不穩(wěn)定或過高？ 制膠時好多泡泡怎么辦？1）首先，玻璃板一定要洗干凈，用洗潔凈洗，沖干凈后再用雙蒸水沖一，晾干。即使在上膠時液面上有氣泡，加水后也會浮上來。7）分離膠中的氣泡與插梳子
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