[醫(yī)藥衛(wèi)生]基因擴增技術pcr-wenkub
2023-04-06 06:52:28 本頁面
【正文】 系統(tǒng)或特異性 DNA序列體外引物定向酶促擴增法 ， 在 模板 DNA， 引物（ 模板兩端的已知序列 ） 和 四種脫氧核苷酸 存在的情況下 ， DNA聚合酶依賴的酶促合成反應 。 1993年獲諾貝爾化學獎 PCR的種類 ? amp。 不對稱 PCR ? amp。 C 加熱 30”1’。 C 1000堿基 /分鐘 在 TagDNA聚合酶的作用下 ， 以 dNTP為反應原料 ， 靶序列為模 板，引物為起始點，按堿基配對原理合成一條新的復制鏈。 每一循環(huán)的產物可以作為下一個循環(huán)的模板 ， 從理論上講 ， 每經過一循環(huán) ， 樣本中的 DNA量應該增加一倍 ，擴增 DNA產量是以指數形式上升的 ， 既 n個循環(huán)后 ， 產量為 2n， 經過 2530個循環(huán)后 DNA可擴增 106109倍 。 演示 PCR反應的過程！ PCR反應體系組成 （ 1） DNA模板 （ 2） 引物 （ 3） dNTP （ 4） 耐熱的 DNA聚合酶 （ 5） 10 PCR緩沖液 (含 Mg++) 模板核酸 ? PCR可以以 DNA或 RNA為模板進行核酸的體外擴增。 引物設計原則： 軟件 +經驗 ? 引物長度以 1530個堿基為宜； ? 引物堿基盡可能隨機分布， G+C含量宜在 45~55%左右； ? 引物內部不應形成二級結構； ? 兩個引物之間不應形成二級結構； ? 引物與核酸序列數據庫的其他序列無明顯同源性； ? 兩個引物的 Tm值要盡可能接近。 Tris是一種雙極性離子緩沖液 ， 其主要作用是維持 堿性 的 Taq酶作用環(huán)境 。 Mg2+濃度直接影響著酶的活性與忠實性 、 引物的退火 、 模板與 PCR產物的解鏈溫度 、 產物的特異性以及引物二聚體的形成等等 。（ 一般 Mg終濃度為 ,不見帶時加到 但要小于 3，見雜帶時但應大于 ） 三磷酸脫氧核苷 （ dNTPs） 四種三磷酸脫氧核苷 （ dATP、 dCTP、 dGTP、dTTP） 是 DNA合成的基本原料 ， 工作濃度應為20~200?mmol/L。 該酶的應用濃度一般為 1~?L反應體系 ， 然而 ， 酶的用量可依據不同的模板分子或引物而變化 。 ? 在逆轉錄過程中 ， “ 持家基因 ” 的 mRNA與待測模板的mRNA共同逆轉錄為 cDNA， 因此排除了 cDNA合成效率不同所引起的誤差 。 ? RNA 特異性的檢測 ， 注意假基因的干擾 。 RTPCR實驗的策略 優(yōu)化 Mg2+濃度 應用不包含 Mg2+的 PCR緩沖液 ， 將 10mmol/L M g C l 2貯存液逐一加入反應管中 。 縮短合成時間（適用于非特異大片段） RTPCR實驗的策略 模板中 G+C比例過高 可加 110%二甲基亞砜 （ DMSO） ， 使模板易于解鏈和引物特異性的結合 。 RTPCR實驗的策略 PCR污染的對策 隔離不同的實驗操作區(qū) ， 將提取 RNA操作區(qū) 、 引物 分裝區(qū)、 PCR操作區(qū)及 PCR產物分析區(qū)分開； 分裝試劑 ， 把試劑分裝成小份 ， 在冰箱中保存 。 重復實驗：為防止因各種原因引起的實驗 誤差，應進行反復驗證，以確 保實驗結果的重演性。 巢式 PCR(nested PCR) 對于極微量的靶序列 ， 一次擴增很難取得滿意的效果 ， 則可用巢式 PCR進行多次擴增 。 熒光定量 PCR技術的整個操作過程在完全封閉的狀態(tài)下進 行，有效的避免了 “ 假陽性 ” 的實驗結果。 熒光染料摻入法 某些染料能夠特異性地結
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