【正文】 胞雜交過程 植物細(xì)胞 A 植物細(xì)胞 B 去掉細(xì)胞壁 去掉細(xì)胞壁 原生質(zhì)體 A 原生質(zhì)體 B 原生質(zhì)體融合 雜合的原生質(zhì)體 再生出細(xì)胞壁 雜種細(xì)胞 細(xì)胞分裂 分化發(fā)育 愈傷組織 雜種植株 植物體細(xì)胞雜交過程 原生質(zhì)體制備（酶解法去細(xì)胞壁） 原生質(zhì)體融合（人工誘導(dǎo)） 雜種細(xì)胞的篩選和培養(yǎng)（形成愈傷組織） 雜種植株的再生與鑒定 物理法： 離心、振動、電刺激等 化學(xué)法： 聚乙二醇等試劑 纖維素酶、果膠酶等 問題 ? 為什么“番茄 — 馬鈴薯”超級雜種植株沒有如科學(xué)家所想像的那樣，地上長番茄、地下結(jié)馬鈴薯？ ? 主要原因是：生物基因的表達不是孤立的，它們之間是相互調(diào)控、相互影響的，所以馬鈴薯 — 番茄雜交植株的細(xì)胞中雖然具備兩個物種的遺傳物質(zhì)，但這些遺傳物質(zhì)的表達受到相互干擾，不能再像馬鈴薯或番茄植株中的遺傳物質(zhì)一樣有序表達，雜交植株不能地上長番茄、地下結(jié)馬鈴薯就是很自然的了。 ②外植體塊在培養(yǎng)基上形成疏松的愈傷組織，由愈傷組織分化出芽并可誘導(dǎo)形成根的小植株。 受精卵的全能性最高； 其次是生殖細(xì)胞（尤其是卵細(xì)胞）； 體細(xì)胞的全能性比生殖細(xì)胞低得多。 細(xì)胞工程的核心技術(shù)：細(xì)胞培養(yǎng)與繁殖 目的：獲得新性狀、新個體、新物質(zhì) 一 細(xì)胞工程的定義 第一節(jié)、細(xì)胞工程的概念與研究范疇 二 細(xì)胞工程的研究范疇 ?細(xì)胞融合 ?細(xì)胞拆分 ?動物細(xì)胞與組織培養(yǎng) ?植物細(xì)胞與組織培養(yǎng) ?細(xì)胞核移植 ?染色體工程 ?胚胎工程 ?干細(xì)胞與組織工程 三、細(xì)胞工程的發(fā)展 1 動物細(xì)胞工程的發(fā)展 2 植物細(xì)胞工程的發(fā)展 ?細(xì)胞學(xué)說的建立 ?胚胎學(xué)的發(fā)展 ?分子生物學(xué)的發(fā)展 四、細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ) 五、細(xì)胞工程的基本技術(shù) 植物細(xì)胞工程 植物細(xì)胞工程的基本技術(shù)和理論基礎(chǔ) 植物細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)是： 植物細(xì)胞的全能性 植物細(xì)胞工程常用的技術(shù)是 植物組織培養(yǎng) 植物體細(xì)胞雜交 概念： 細(xì)胞的全能性是指生物體的細(xì)胞具有使后代細(xì)胞形成完整個體的潛能。 原因： 是生物體的每一個細(xì)胞都含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)及發(fā)育為完整個體所必需的全部基因。 ① 從健康植株的特定部位或組織，如根、莖、葉、花、果實、胚珠、花藥和花粉等，選擇用于組織培養(yǎng)的起始材料，稱之為外植體。 1）植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù) 植物組織培養(yǎng)的過程 離體的植物器官、組織或細(xì)胞 脫分化（又叫去分化） 愈傷組織 （排列疏松而無規(guī)則，高度液泡化的呈無定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞） 再分化 根或芽等器官 植物體 植物組織培養(yǎng)的條件： 適宜的養(yǎng)料和激素，適宜的溫度和無菌條件 離體的植物器官、組織或細(xì)胞 愈傷組織 根 芽 植物體 脫分化 再分化 脫分化 由高度分化的植物器官、組織或細(xì)胞產(chǎn)生愈傷組織的過程，稱為植物細(xì)胞的脫分化。 問題 ? 自然界中有一種含有葉綠體的原生動物 ──眼蟲，說明植物的細(xì)胞器同樣可以在某些動物細(xì)胞中存活，請?zhí)接懀簞游锛?xì)胞與植物細(xì)胞之間可以實現(xiàn)雜交嗎？如果理論上可行，請設(shè)計出具體實驗方案。 小規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)通常在培養(yǎng)瓶中完成 ， 而大規(guī)模的培養(yǎng)可在發(fā)酵罐中進行 。 可在植物細(xì)胞培養(yǎng)基中加入煙酸 、 吡哆醇 、 泛酸 、 生物素和葉酸等 。 有機氮源 通常采用的有機氮源有 蛋白質(zhì)水解物 、 谷氨酰胺或氨基酸混合物 等 。 類型和方法 :懸浮培養(yǎng)和固定培養(yǎng) 懸浮培養(yǎng)方法 要求 :材料 (疏松易碎的愈傷組織 ,經(jīng)過破碎的頸部組織 ) 條件 :水平震蕩 ,合適的氣體組成 /pH 特點 :對剪切力敏感 結(jié)團 生長速度慢 多泡沫 光照 無菌培養(yǎng) 圖 122大規(guī)模植物細(xì)胞固定化裝置 含 CaCl2的培養(yǎng)基 蓋子 空氣出口 海藻酸鈉 +細(xì)胞懸浮液 噴嘴 無菌空氣入口 大規(guī)模固定化植物細(xì)胞的大規(guī)模固定化原則上可根據(jù)上述方法進行 ， 但是不能再用塑料注射器 ，而需要采用如圖 122所示的大規(guī)模細(xì)胞固定化裝置進行細(xì)胞的固定化 。 在京展出的數(shù)天，盡管門票高達 20元，但還是有將近 20萬人，心甘情愿地掏錢一睹 “ 人耳鼠 ” 的風(fēng)采。蝌蚪的神經(jīng)組織存活了好幾周，并且從神經(jīng)細(xì)胞中長出了神經(jīng)纖維。 （分解彈性纖維） 有關(guān)概念 ?原代培養(yǎng) ：從機體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞為原代細(xì)胞。 細(xì)胞株和細(xì)胞系的區(qū)別 ： 細(xì)胞系的遺傳物質(zhì)改變，具有癌細(xì)胞的特點，失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)。 細(xì)胞培養(yǎng)以玻璃器皿為主。 【 討論 】 多細(xì)胞動物和人體的細(xì)胞都生活在內(nèi)環(huán)境中，討論以下問題： ？ 提示：充足的營養(yǎng)供給、適宜的溫度、適宜的 pH和氣體環(huán)境。 ℃ ，偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。 3) 氣體： ?ＣＯ ２ 有調(diào)節(jié) PH的作用。 4）營養(yǎng) — 培養(yǎng)基： ? 在保證細(xì)胞滲透壓的情況下，培養(yǎng)液里的成分要滿足細(xì)胞進行代謝所需要的各種營養(yǎng)，如包括十幾種必需氨基酸及其他多種非必需氨基酸、維生素、碳水化合物及無機鹽類等。合成培養(yǎng)基的種類相當(dāng)多。 ?人工合成培養(yǎng)基，如 109培養(yǎng)液、 DMEM、19 ? RPMI1640， IMEM， MEM培養(yǎng)液等。 使用最普遍的天然培養(yǎng)基是血清，基本以小牛血清最普遍。牛血清分為 胎牛血清和犢牛血清 ，前者來源少，價格高；后者要求剛產(chǎn)下尚未哺乳的小牛，因為哺乳后的小牛血清中可能含有更復(fù)雜的成分。激素有胰島素、生長激素和多種生長因子如表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、增殖刺激因子(MSA)、類胰島素生長因子 (IGFl、 IGF2)等。膠原是從動物真皮中提取的，具改善細(xì)胞表面特性促使其附著生長的作用。 無血清培養(yǎng)基不加動物血清，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入細(xì)胞生長有效因子，激素等。 6)、無污染環(huán)境 ? 培養(yǎng)環(huán)境無毒和無菌是保證細(xì)胞生存的首要條件。細(xì)胞培養(yǎng)室和設(shè)計原則是防止微生物污染和有害因素影響，要求工作環(huán)境清潔、空氣清新，干燥和無煙塵。 ?操作間放置凈化工作臺及二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機及倒置顯微鏡等。 超凈工作臺 ?也稱凈化工作臺，分為側(cè)流式、直流式和外流式三大類。 ?水純化裝置 細(xì)胞培養(yǎng)對水的質(zhì)量要求較高。 ?細(xì)胞冷凍貯存器 細(xì)胞冷凍貯存具有經(jīng)濟、省力和較好保持細(xì)胞生物學(xué)特性的優(yōu)點，目前各實驗室主要使用液氮容器貯存細(xì)胞。 無菌操作的要領(lǐng) ? 由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞缺乏機體抗感染功能，所以在一切操作中要努力作到最大限度的無菌，防止污染。 注意金屬器械不能在火焰上燒灼時間過長。 酒精燈置于中央，打開的培養(yǎng)液、培養(yǎng)瓶等應(yīng)保持斜立或平放（瓶口長時間開口直立 ,易增加落菌機會）。 細(xì)胞融合概述 細(xì)胞融合（ cell fusion)， 又稱體細(xì)胞雜交（ somatic hybridiazation），是指兩個或更多個相同或不同細(xì)胞通過膜 融合形成單個細(xì)胞的過程。 ?1975年 Kohler和 Milstein成功地融合了小鼠 B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞而產(chǎn)生能分泌預(yù)定單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。 ?融合過程 不存在有性雜交過程中的種性隔離機制的限制 ，為遠緣物種間 的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。并使兩細(xì)胞相互凝聚； ②在 37℃ 中，病毒與細(xì)胞膜發(fā)生反應(yīng)，細(xì)胞膜受到破環(huán)，此時需 要 Ca2+和 Mg2+，最適 PH為 ； ②細(xì)胞膜連接部穿通，周邊連接部修復(fù)，此時需Ca2+和 ATP； ④融合成巨大細(xì)胞，仍需 ATP 。 ?PEG濃度以 W/W；如將 10克 PEG與 10mlEagLe氏液混合（假定 1ml培養(yǎng)液為 1g重 )，即成 50％ PEG溶液。 二、聚乙二醇（ PEG）法 聚乙二醇（ PEG）法細(xì)胞融合過程 ?PEG的作用機理 ： Kao等認(rèn)為，由于 PEG分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成 H鍵，從而在在質(zhì)膜之間形成分子橋，其結(jié)果是使細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進而促使質(zhì)膜的融合；另外， PEG能增加類脂膜的流動性，也使細(xì)胞的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。 （ 6） 6—24小時后，換成選擇培養(yǎng)液篩選雜交細(xì)胞。 電融合誘導(dǎo)法原理示意圖 雜種細(xì)胞的篩選 雜種細(xì)胞的篩選 ? 原理： 兩種親本細(xì)胞融合的混合物中可能有多種類型細(xì)胞，篩選的目的是獲得優(yōu)良的雜種細(xì)胞。 ?如： ?親本 1：對放線菌素 D抗性，但在 MS培養(yǎng)基上不能超過 50個世代 ?親本 2：對放線菌素 D很敏感，但能在MS上生長 ?雜種細(xì)胞能在含有放線菌素的 MS培養(yǎng)基上生長，而親本和其它細(xì)胞死亡 3） 利用物理特性篩選法： 根