動(dòng)物基因組dna的分離定量葉-wenkub
2023-05-23 08:50:25 本頁(yè)面
【正文】 mmol/L Tris ? 在高鹽條件下，用乙醇沉淀 DNA ? DNA不溶于乙醇，乙醇可以沉淀 DNA。EDTA； SDS ；蛋白酶 K；無 DNA酶的 RNA酶 實(shí) 驗(yàn) 原 理 ? 用蛋白酶 K水解蛋白質(zhì) ? 蛋白酶 K具有廣泛的切割活性，可消化細(xì)胞，降解蛋白質(zhì)。EDTA可抑制 DNA酶的活性。 實(shí) 驗(yàn) 目 的 ? 通過實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)從動(dòng)物組織中制備染色體 DNA的方法。實(shí)驗(yàn)一、動(dòng)物基因組 DNA的分離 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^本實(shí)驗(yàn)了解并掌握提取基因組 DNA的原理和步驟。 ? 學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè) DNA的純度、 DNA的構(gòu)型、含量以及分子量的大小。 ? NaCl。 ? 有機(jī)溶劑酚、氯仿抽提 ? 苯酚使蛋白質(zhì)變性，同時(shí)抑制了 DNase的降解作用。 ? NaAc： Na+中和 DNA分子上的負(fù)電荷，減少 DNA分子之間的同性電荷相斥力，而易于聚集沉淀 。HCl， pH 25 mmol/L EDTA， pH % SDS （臨用前加）。 TE緩沖液 ： 10 mmol/L Tris 無水乙醇。 取 g組織塊剪碎后，加入 mL勻漿緩沖液，用組織勻漿器勻漿至無明顯組織塊存在（冰浴操作）。 6．加入 1/10倍體積 3M NaAc（ ）， 2倍體積無水乙醇 充分混勻 ， 20℃ 下 1520min。 。l DNA %瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)記錄和分析結(jié)果，估計(jì)樣品 DNA分子量。 DNA制備注意事項(xiàng) ，不可用槍頭 (尤其是沒剪去槍頭尖端）吹打沉淀。 實(shí)驗(yàn)二 .DNA濃度與純度的測(cè)定 DNA濃度的分光光度計(jì)測(cè)定 原理： 核酸的紫外吸收 ? 堿基含有共軛雙鍵，使相關(guān)化合物在 240290 nm的紫外波段有強(qiáng)烈的吸收峰， 最大吸收 值在260nm左右 ? 組成核酸分子的堿基，均具有一定的吸收紫外線特性，最大吸收值的波長(zhǎng)為 250～ 270 nm之間。 RNA樣品含有蛋白質(zhì)會(huì)使 A260/A280比值下降 。 ，應(yīng)在檢測(cè)范圍之內(nèi)。 DNA分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)，在用電泳法測(cè)定 DNA分子大小時(shí)，應(yīng)當(dāng)盡量減少電荷效應(yīng)?？蓞⒄障卤恚? 瓊脂糖凝膠濃度％ 線性 DNA的有效分離范圍／ kb 5— 60 1— 20 — 10 — 7 — 6 — 4 — 3 實(shí)驗(yàn)用 ％瓊脂糖。 加梳子，倒膠： 將有機(jī)玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子，將冷到 60℃ 左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入有機(jī)玻璃內(nèi)槽，直至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠面 (注意不要形成氣泡 )。 ? 凝膠上樣緩沖液（ 6 ） 蔗 糖 40％ 溴酚藍(lán) ％
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