【正文】 ts that were treated with exogenous geraniol and 3 hexenol. The results showed that geraniol and 3 hexenol could trigger the defensive response in tomato fruits. Compared with geraniol, 3 hexenol treatment had obvious wounding effect on fruit, triggering more increased activities of polyphenol oxidase. With time extending of geraniol or 3 hexenol treatment, the expression of CDI, PS, and inhII gene induced by alcohol was higher, but since the LOX gene belongs to early expression gene, the expression of LOX induced by the alcohol was lower with geraniol or 3 hexenol treatment time prolonging. Keywords: Polyphenol oxidase。結(jié)果表明， 香葉 醇和 葉 醇誘導(dǎo)能夠引起植物的防御性反應(yīng)。 與 香葉醇 相比，葉醇處理對(duì)果實(shí)的傷害作用更為明顯，引發(fā)了更多的 多酚氧化酶 活性的提高。 Defense response。這些防御措施可以分為組成型和誘導(dǎo)型兩種。誘導(dǎo)型的防御反應(yīng)是指植株在受到害蟲(chóng)危害時(shí)而表現(xiàn)出來(lái)的一種防御性反應(yīng)，這可以 分為直接誘導(dǎo)防御反應(yīng)和間接誘導(dǎo)防御反應(yīng) [1] 。至今，已經(jīng)有了很多的研究表明植物體內(nèi)的水楊酸、茉莉酸、過(guò)氧化氫以及乙烯等信號(hào)分子在植物的蟲(chóng)害誘導(dǎo)防御反應(yīng)中起到了重要的作用。其揮發(fā)性衍生物茉莉酸甲酯是蛋白酶抑制子的一種誘導(dǎo)物 (Farmer 和 Ryan 1990)。也能夠產(chǎn)生對(duì)害蟲(chóng)有驅(qū)避和妨礙其行為的化合物，從而干擾昆蟲(chóng)的行為。外源 JA 和 MeJA 誘導(dǎo)植物產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)化合物可以引誘寄生性天敵或驅(qū)避植食性昆蟲(chóng)。如在植物的過(guò)敏性反應(yīng)中， JA 合成途徑中的一些基因如脂氧合酶等表達(dá)的水平明顯上調(diào)。例如 SA 處理能夠提高柳樹(shù)的抗性 [3]，降低了蟲(chóng)的成活率。 水楊酸信號(hào)途徑在抗病防御中的作用 SA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在植物抗病中的作用已經(jīng)有了很多的研究。 HR 發(fā)生后，還會(huì)誘導(dǎo)整株植物對(duì)同一種病原或其他病原產(chǎn)生抗性，即形成了系統(tǒng)獲得性抗性 (systemicacquiredresistance， SAR)。 乙烯 (ethyene， ET)信號(hào)途徑 乙烯的合成 幾乎所有的植物組織都能夠產(chǎn)生 ET，但是在大多數(shù)情況下濃度都會(huì)很低。 (2)AM 在 ACC 合酶 (ACCsynthase， ACS)的催化下產(chǎn)生了氨基環(huán)丙烷梭酸(laminoeyelopropane 小 earbo 翔 lieaeid， ACC)和 5’ 甲硫腺昔 (MethylthioadenosineMTA)。 (3)ACC 在 ACC 氧化酶 (ACCoxidase， ACO)的催化下產(chǎn)生了 ET。 ET 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在褐飛虱為害誘導(dǎo)的水稻揮發(fā)物釋放中是必需的。在褐飛虱為害之前利用 ET 受體的抑制劑 1甲基環(huán)丙稀處理水稻，可明顯抑制褐飛虱誘導(dǎo)的大部分水稻揮發(fā)物組分，并且對(duì)稻虱纓小蜂的引誘作用也受到抑制。黑點(diǎn)為檢測(cè)到的有效數(shù)據(jù) 。 過(guò)氧化氫 (hydrogenperoxide， HZoZ)信號(hào)途徑 植物在遇到各種環(huán)境侵害，如低溫、高 溫、高鹽、干早、高滲透壓及病原感染等，植物自身會(huì)發(fā)生應(yīng)激保護(hù)措施。 Legendre 等用柑桔果膠制備的寡聚半乳糖醛酸也能誘導(dǎo)大豆懸浮培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生 H202。(3)促進(jìn)寄主細(xì)胞壁的木質(zhì)化和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白的交聯(lián)使得細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)得以增強(qiáng)是病原菌侵染后植物產(chǎn)生的主要防御反應(yīng)之一 。在煙草 NICotianaattenuata 的研究中也發(fā)現(xiàn)， glP 基因與煙草體內(nèi) HZoZ 的產(chǎn)生有關(guān) 。說(shuō)明 H202 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能在水稻揮發(fā)物的合成中起作用。水楊酸、茉莉酸和乙烯 ,各個(gè)信號(hào)途徑之間也可以相互影響 [9]。很多報(bào)道都認(rèn)為茉莉酸和乙烯具有協(xié)同作用 ,它們能夠協(xié)同激活編碼防御蛋白 (如蛋白酶抑制劑 )的基因。茉莉酸處理野生型擬南芥能增加其對(duì)埃及棉葉蟲(chóng)的抗性。傷口和茉莉酸誘導(dǎo)的反應(yīng)不產(chǎn)生乙烯 ,但煙草天蛾取食能誘導(dǎo)乙烯大量產(chǎn)生 ,并在幼蟲(chóng)取食過(guò)程中一直存在。 防御相關(guān)基因的表達(dá) 自從 Green and Ryan (1972)報(bào)道了植食者取食后植物隨后發(fā)生的化學(xué)變化提高對(duì)昆蟲(chóng)攻擊的抵抗能力，人們廣泛認(rèn)識(shí)到植物的化學(xué)組成不僅受非生物因子影響，而且也在相當(dāng)程度上受機(jī)械損傷或植食者取食的影響。該領(lǐng)域的研究為了解植物和植食者之間的相互適應(yīng)和協(xié)同進(jìn)化，也為害蟲(chóng)治理提供新的思路和手段。在研究擬南芥 (Arabidopsis thaliana)葉片在機(jī)械損傷、水分脅迫和菜青蟲(chóng)取食后 150 種基因表達(dá)的時(shí)機(jī)、動(dòng)態(tài)和調(diào)控后，發(fā)現(xiàn)有一種基因的表達(dá)只受昆蟲(chóng)取食誘導(dǎo) (Reymond et al., 2020)。由此可見(jiàn)，植物在害蟲(chóng)為害后大量的基因表達(dá)受到改變，其中部分基因的誘導(dǎo)表達(dá)起到抗蟲(chóng)的作用。由于有些信號(hào)基因的產(chǎn)物除了起到信號(hào)傳播作用外還直接對(duì)昆蟲(chóng)有防御功能，這時(shí)信號(hào)途徑基因和防御物質(zhì)合成基因并不能截然分開(kāi) 西南科技大學(xué)本科生畢業(yè)論文 16 防御蛋白基因 蛋白酶抑制劑 （ proteinase inhibitor, PIN） 基因 PIN 是小分子蛋白質(zhì)，對(duì)昆蟲(chóng)有防御作用。昆蟲(chóng)損傷還誘導(dǎo)玉米、馬鈴薯、水稻和西紅柿的 PIN 基因的表達(dá) (Anderson et al., 1997)。傷口誘導(dǎo)的信號(hào)傳輸途徑激活了 CPIN 對(duì)害蟲(chóng)和病原菌攻擊的反應(yīng)。至少在茄科植物， SPIN mRNA 局部和系統(tǒng)性的積累是植物防御反應(yīng)的一個(gè)組成部分，這種反應(yīng)是由害蟲(chóng)或病原菌攻擊發(fā)起并由最終調(diào)控解碼這些蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄的信號(hào)傳導(dǎo)所決定的。損傷后 MBP 的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物積累于新老葉片上，并且在幼齡植西南科技大學(xué)本科生畢業(yè)論文 17 株上系統(tǒng)地表達(dá) (Taipalensuu et al., 1997)。 過(guò)氧化物酶基因 過(guò)氧化物酶基因表達(dá)受損傷的誘導(dǎo)。 多酚氧化酶基因 多酚氧化酶明顯降低昆蟲(chóng)飼料中的蛋白質(zhì)的含量，從而減少取食這種飼料的幼蟲(chóng)的生長(zhǎng) (Felton et al., 1992)。 P450 調(diào)節(jié)植物次生代謝合成中的許多氧化反應(yīng)，包括苯基異丙酮和植物抗毒素。在植物中檢測(cè)到的最突出和獨(dú)特的 P450 活性是反式 苯乙烯酸羥化酶 tCAH 活性 (Schuler, 1996)。脂肪氧合酶基因的表達(dá)是傷口和病原物攻擊 誘導(dǎo)的，是植物內(nèi)源防御體系的一部分。馬鈴薯中 LOXH3 基因的反義缺失使得馬鈴薯降低 PIN 損傷誘導(dǎo)水平，提高取食害蟲(chóng)的重量。損傷誘導(dǎo)的 AOS 基因表達(dá)的積累需要重新生物合成參與調(diào)控 AOS 基因表達(dá)的信號(hào)傳輸途徑的蛋白質(zhì)，而且 AOS mRNA 的積累與茉莉酮酸酯水平的提高相關(guān) [16]。 外界脅迫因子如水分、鹽度和紫外光等 的脅迫也能影響植物防御害蟲(chóng)的基因表達(dá)。這些研究表明植物對(duì)害蟲(chóng)和其他脅迫因子的防御反應(yīng)可能分享相同的信號(hào)途徑。 本研究以香葉醇和葉醇誘導(dǎo)的番茄果實(shí)為材料，通過(guò)測(cè)定果實(shí) 多酚氧化酶活性和防御相關(guān)基因的表達(dá) ，研究了醇誘導(dǎo)下番茄果實(shí)的防御反應(yīng)，為了解番茄果實(shí)的次生代謝及受傷防御反應(yīng)奠定一定的理論基礎(chǔ)。 TRIZOL： Invitrogen 公司 反轉(zhuǎn)錄 試劑盒： TakaRa 公司。L移液器 、 北京普析 TU1900雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 、 Eppendorf Research 100181。 2) 粗酶液制備 將洗凈的研缽放入冰箱冷凍室（ 20℃）中預(yù)冷 4h，然后將 4g樣品分別放入加有 4ml 的磷酸緩沖提取液的研缽中進(jìn)行研磨，研好的樣品分裝于 的離心管中，并在 10， 000rpm/min 的條件下離心 20min，取上清液即為 PPO 的粗酶液。 母液 B： mol/L NaH2PO4 溶液。 西南科技大學(xué)本科生畢業(yè)論文 22 防御相關(guān)基因的 誘導(dǎo)表達(dá)情況 RNA 專(zhuān)用試劑和耗材的處理 在 RNA 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，任何環(huán)節(jié)的不正確操作都可能導(dǎo) 致 RNA 酶的污染。 C 的烘箱中烘烤 4 h 以上。 SDS 及 Tris 溶 液：取新開(kāi)封的藥品，用 DEPC 處理過(guò)并經(jīng)高壓滅菌的水配 制。 果實(shí) RNA 的提取 1) 取 80℃冰箱內(nèi)保存 的處理過(guò)的番茄 果實(shí) 24 克，加入液氮研磨成粉狀，迅速轉(zhuǎn)移 100200mg 粉末于不含 RNase 的 mL Ep 管中，即刻加入 1 mL TRIZOL， 在 vortex 上振蕩 10s，然后將勻漿樣品在室溫孵育 5 min 以使核蛋白體完全分解； 2) 加 mL 氯仿，蓋緊 Ep 管蓋，用手劇烈振蕩 15 s 并于室溫孵育 23 min； 3) 4176。倒掉上清液，用 75%的乙醇 1 mL 洗滌RNA 沉淀 12 次，旋渦振蕩混合樣品后， 4176。 C 溫育 5 min，迅速置冰浴中，加樣如下： 1 μ L RNase Inhibitor 1 μ L dNTP (10 mmol/L) 8 μ L 5 buffer 1 μ L MMLV reverse transcriptase 混勻，短暫離心， 42176。 2） RealTime PCR 反應(yīng) : 用 RealMasterMix(SYBR Green)試劑 （ TIANGEN Biotech 公司）進(jìn)行，每組樣品重復(fù)三次。 Reverse Primer (10 μ M) 1μ L cDNA 模板 1μ L RNasefree ddH2O 8μ L 西南科技大學(xué)本科生畢業(yè)論文 25 第 3章 結(jié)果與分析 香葉醇和葉醇的誘導(dǎo) 對(duì) 番茄果實(shí)多酚氧化酶活性 影響 多酚氧化酶 (PPO)是 催化酚類(lèi)氧化的各種酚酶 的總稱(chēng)， 通常包括多酚氧化酶、絡(luò)氨酸酶和兒茶酚酶。 研究已經(jīng)表明， PPO 含量和活性是組織產(chǎn)生褐化的內(nèi)在原因，它與植物的防御反應(yīng)有關(guān)。 圖 1 香葉醇和葉醇 誘導(dǎo) 下番茄果實(shí)的 PPO 比活性 （ 525nm 波長(zhǎng)） 從 圖 1 可以看出，與未處理的對(duì)照相比， 噴施 10mM 香葉醇 和葉醇均引起多酚氧化酶活 性的提高，且隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活性也明顯增加。葉醇處理1d 和 3d 時(shí)， 多酚氧化酶比活性 (410nm 波長(zhǎng)下 )為 和 ，分別是對(duì)照組的 和 倍；而 香葉醇處理 1d 和 3d 后測(cè)得 的多酚氧化酶比活性 僅是對(duì)照組的 和 倍。 西南科技大學(xué)本科生畢業(yè)論文 27 醇處理對(duì)防御相關(guān)基因 LOX, CDI, PS, inhII表達(dá) 的影響 熒光定量 PCR 擴(kuò)增效率、相關(guān)系數(shù)和溶解曲線 圖 3 基因的擴(kuò)增曲線 在熒光定量 PCR 儀上， 通過(guò) 熒光定量 PCR 獲得了基因的擴(kuò)增曲線。如在 Arabidopsis(Belland Mullet, 1993)、大豆 (Sarawitz and Siedow, 1996)、 馬鈴薯 (Royo et al., 1996)上的 LOX mRNA 積累可由昆蟲(chóng)攻擊引起。 可見(jiàn) LOX 基因的表達(dá)水平與植物的防御反應(yīng)相關(guān)。 結(jié)果表明 LOX 屬于早期基因，隨著香葉醇或葉醇處理的時(shí)間延長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)醇誘導(dǎo)的 LOX 基因表達(dá) 量越低。香葉醇和葉醇浸泡組的 CDI 基因 相對(duì)表達(dá)量分別是葉醇處理 1d 的 和 倍。葉醇處理 3d 時(shí)，其相應(yīng)的 PS 基因 相對(duì)表達(dá)量是葉醇處理 1d 的 倍。 PIN 抑制昆蟲(chóng)消化性蛋白酶，導(dǎo)致昆蟲(chóng)由于饑餓而生長(zhǎng)遲緩和死亡。受損傷誘導(dǎo)的 PIN 基 因主要有半胱氨酸蛋白酶抑制劑 CPIN、絲氨酸蛋白酶抑制劑 SPIN 和胰島素蛋白酶抑制劑 TPIN 基因。 結(jié)果表明 隨著香葉醇或葉醇處理的時(shí)間越長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)醇誘導(dǎo)后的 inhII 基因的表達(dá) 量越高。 噴施時(shí)間相同和浸泡的時(shí)間相同 的 情況下，與 香葉醇 相比，葉醇處理對(duì)果實(shí)的傷害作用更為明顯，引發(fā)了更多的 多酚氧化酶 活性的提高。 結(jié)果表明隨著香葉醇誘導(dǎo)的時(shí)間 延 長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)香葉醇誘導(dǎo)的 PS 基因的表達(dá)量越低；隨著葉醇誘導(dǎo)的時(shí)間 越長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)葉醇誘導(dǎo)的 PS 基因的表達(dá) 量越高，同時(shí) 香葉醇和葉醇浸泡組的 PS 基因 表達(dá)量 最高。 在此 還要感謝所有教導(dǎo)過(guò)我的老師，感謝你們?cè)诖髮W(xué) 期間 間對(duì)我人生觀、價(jià)值觀的引導(dǎo)。donnell PJ, Calvert C, Atzorn R. Ethylene as a signal medi