基因工程第三章2-jun-finalversion(已修改)
2025-01-15 17:56 本頁(yè)面
【正文】 Cloning Vectors第三章 基因工程載體第三章第三章 基因克隆載體基因克隆載體l 第一節(jié) 質(zhì)粒載體l 第二節(jié) 噬菌體載體l 第三節(jié) 真核細(xì)胞的克隆載體第二節(jié) 噬菌體載體? 一、噬菌體的一般生物學(xué)特性? 二、 λ 噬菌體載體? 三、粘性質(zhì)粒? 四、單鏈 DNA噬菌體載體一、噬菌體的一般生物學(xué)特性 噬菌體是比細(xì)菌還小得多的微生物，和病毒侵犯真核細(xì)胞一樣，噬菌體侵犯細(xì)菌，也可以認(rèn)為它是細(xì)菌里的 “ 寄生蟲(chóng) ” 。它本身是一種 核蛋白 ，核心是一段 DNA，結(jié)構(gòu)上有一個(gè)蛋白質(zhì)外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的 DNA注入細(xì)菌內(nèi)。噬菌體的結(jié)構(gòu)? 烈性噬菌體? 溫和噬菌體? 溶源化細(xì)菌? 溶源化? 原噬菌體噬菌體的侵染與包裝二、 λ 噬菌體載體λ 噬菌體的電子顯微鏡照片 a) 在噬菌體內(nèi)呈 線性雙鏈 DNA分子 (48502bp)，編碼 50多個(gè)基因，在兩端各有 12個(gè)堿基組成的 5’ 單鏈互補(bǔ)粘性末端 (Cohesive end),進(jìn)入宿主細(xì)胞后 ,粘性末端連接形成環(huán)狀分子 (Cos位點(diǎn) )，是包裝的必需DNA序列． 5’GGGCGGCGACCTXX…XXG3’ XX…XXCCCCGCCGCTGGA5’ b) λ 基因組 DNA上有 56種限制酶識(shí)別位點(diǎn)． 基因組 DNA的特點(diǎn)（一） λ DNA 分子λ 噬菌體基因大致分為 4個(gè)區(qū)： 結(jié)構(gòu)區(qū) A～ J19個(gè)基因， 編碼頭、 尾部蛋白質(zhì)為 結(jié)構(gòu)區(qū) ,重組區(qū) att（ attachment）、 int（ intagrate）及xis（ excission）， 調(diào)控區(qū) 啟動(dòng)子、終止子和 NCI基因， OR 為 裂解區(qū) . λ 噬菌體的基因組圖及 EcoRI酶切圖2. λ 基因組 DNA的結(jié)構(gòu)l A：成熟包被，切開(kāi)cos環(huán)，l D,E： (占頭蛋白 75%)l W,F：頭尾連接l Int(整合 ),Xis(刪除),Red促重組l N(早期調(diào)控 )促 O,P(復(fù)制 ).Red,Xis,Int轉(zhuǎn)錄和整合。l Q(晚期調(diào)控 )促頭 ,尾 ,S,R基因表達(dá)和溶菌l CI,CII,CIII為負(fù)調(diào)控，阻止溶菌環(huán)化后的 λ 基因組 DNA? 人為將 λ 噬菌體基因組分為 3個(gè)區(qū)域 ：– 左側(cè)區(qū) ：自基因 A到基因 J，包含外殼蛋白的全部編碼基因。– 中間區(qū) ：介于基因 J和基因 N之間，這個(gè)區(qū)又稱為非必需區(qū)，與噬菌斑形成無(wú)關(guān)，被外源DNA片斷取代后，并不影響噬菌體的生命活動(dòng)。中間區(qū)包含重組基因和整合切割基因。– 右側(cè)區(qū) ：位于 N基因的右側(cè)，包含全部的主要調(diào)節(jié)基因及復(fù)制基因和裂解基因。? 裂解周期– 早期： 環(huán)狀的 λDNA 分子按 θ 型雙向復(fù)制，復(fù)制起點(diǎn)位于 O基因內(nèi)，需要 O、 P基因編碼蛋白的參與。– 晚期： 控制滾環(huán)型復(fù)制的開(kāi)關(guān)被啟動(dòng)，復(fù)制從θ 型轉(zhuǎn)變?yōu)闈L環(huán)型復(fù)制，合成出一系列 λDNA線性排列的多聚體分子。– cos位點(diǎn)是 λ 噬菌體正確包裝的必需位點(diǎn) 。3. λDNA 的復(fù)制λ噬菌體DNA的復(fù)制? 溶原性周期– λDNA 復(fù)制以另外一種形式進(jìn)行，穩(wěn)定的 整合 到宿主染色體上并隨之一起復(fù)制。– cI基因表達(dá) ，合成參與溶菌周期活動(dòng)的所有基因被阻遏的蛋白質(zhì)。– 附著位點(diǎn) att，同大腸桿菌染色體 DNA的局部同源位點(diǎn)之間的 重組 反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。? 原噬菌體的刪除作用– 整合作用需要 int基因的表達(dá)，是一種 可逆的 過(guò)程：一方面，噬菌體基因組可以整合到大腸桿菌染色體 DNA上，成為 原噬菌體 ；另一方面，在適當(dāng)條件下，原噬菌體又可以脫離宿主染色體，重新變成獨(dú)立的復(fù)制子，這種過(guò)程叫做 原噬菌體的刪除作用 。 – λ 噬菌體的刪除，需要噬菌體 xis基因和 int基因的協(xié)同作用才能實(shí)現(xiàn)。4. λ 噬菌體的組裝1. 野生型的 λ 噬菌體不適于直接用作基因克隆載體原因– λDNA 基因組中同一種限制酶具有多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，不利于外源 DNA插入 — 體內(nèi)突變和建立新的克隆位點(diǎn)。– 包裝限制 : λ 噬菌體頭部只能容納自身 DNA的 75105%，即 Kb，天然 λ 僅可插入 源 DNA片段 — 如若除去所有與 λ 裂解無(wú)關(guān)的基因和空白區(qū)，最大可插入 22 Kb。（二） λ 噬菌體載體的構(gòu)建2. λ 噬菌體的改造216。切除非必需區(qū)段（重組基因簇） :1/3 非必需區(qū)段216。切除必需的的 RE識(shí)別位點(diǎn)，在非必需區(qū)引入合適的RE識(shí)別位點(diǎn)216。引入適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記基因以便重組子的篩選 216。建立重組 λDNA 分子的體外包裝系統(tǒng)，通過(guò)無(wú)意義突變將其改造成安全載體，以利于生物學(xué)防護(hù)。1) 除去多余的限制酶識(shí)別位點(diǎn)– 天然的 λDNA 上有多個(gè)酶切位點(diǎn)，如：EcoRI 5個(gè)， HindIII 7個(gè)，這些多余的酶切位點(diǎn)必須被修飾。– 一般利用 自然選擇法 獲得限制性位點(diǎn)缺失的λ 品系。– 自然選擇法可以利用一個(gè)產(chǎn)生 EcoRI的大腸桿菌，大部分侵入細(xì)胞的 λ DNA 分子會(huì)被限制性酶破壞，少部分能夠成活，這些就是突變型的噬菌體，其 EcoRI位點(diǎn)缺失了。 2. λ 噬菌體的改造通過(guò) 自然選擇法 篩選無(wú)EcoRI識(shí)別位
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