【正文】 第八章 微生物的遺傳變異和育種 第一節(jié) 遺傳變異的概念及物質(zhì)基礎(chǔ) 第二節(jié) 基因突變與基因重組 第三節(jié) 微生物育種 第四節(jié) 基因工程 第五節(jié) 菌種保藏 第八章 微生物的遺傳變異和育種 ? 生物體最本質(zhì)的屬性之一。 ? 遺傳，講的是親子間的關(guān)系，指生物的上一代將自己的一整套遺傳因子傳遞給下一代的行為或功能，它具有極其穩(wěn)定的特性。 ? 變異：指生物體遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)或數(shù)量的改變，即遺傳型的改變。 微生物與遺傳學研究： ? 個體結(jié)構(gòu)簡單；營養(yǎng)體多為單倍體；易于在成分簡單的合成培養(yǎng)基上生長繁殖；繁殖速度快；易于累積不同的最終代謝產(chǎn)物及中間代謝物；菌落形態(tài)特征的可見性與多樣性；環(huán)境條件對各個體作用具有直接性和均一性；易于形成營養(yǎng)缺陷型；一般都有相應的病毒；存在多種處于進化過程中的原始有性生殖方式等。 ? 研究現(xiàn)代遺傳學和重要的生物學基本理論問題， 第一節(jié) 遺傳變異的概念及物質(zhì)基礎(chǔ) ? 一、基本概念 ? （一）、遺傳型、基因型：某一生物個體所含有的全部遺傳因子（基因的總和）。 ? 具有某遺傳型的生物只有在適當?shù)沫h(huán)境條件下，通過自身的代謝和發(fā)育，才能將它具體化，即產(chǎn)生表型。 ? 代謝 遺傳型 +環(huán)境條件 表型 發(fā)育 一、基本概念 ? （二）、表型 ： 某一生物體所具有的一切外表特征及內(nèi)在特性的總和，是遺傳型在合適環(huán)境下的具體體現(xiàn)。 ? 表型是一種現(xiàn)實性。 一、基本概念 ? （三）、變異：在某種外因或內(nèi)因的作用下，生物體遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)或數(shù)量的改變，即遺傳型的改變。 ? 變異特點：在群體中以極低的幾率 (一般為 105～ 1010)出現(xiàn)；性狀變化的幅度大；變化后的新性狀是穩(wěn)定和可遺傳的。 一、基本概念 ? （四）、飾變 ： 不涉及遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而只發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、翻譯水平上的表型變化。 ? 飾變特點：整個群體中每一個體都發(fā)生同樣變化；性狀變化的幅度??；飾變性狀不遺傳。 ? 例如，粘質(zhì)沙雷氏菌 25℃ 培養(yǎng)，產(chǎn)生深紅色靈桿菌素，把菌落染成鮮血似的 (因此過去稱它為“神靈色桿菌”或“靈桿菌” )； 37℃ 時，群體中所有個體都不產(chǎn)色素。重新降溫至 25℃ ，所有細胞產(chǎn)色素能力又可以恢復。 二、證明核酸是遺傳變異 物質(zhì)的經(jīng)典實驗 ? （一）、轉(zhuǎn)化實驗 ? （二）、噬菌體感染實驗 ? （三）、植物病毒的重建實驗 （一）轉(zhuǎn)化實驗 ? 英， ， 1928年研究肺炎鏈（雙）球菌發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)變現(xiàn)象。 ? 肺炎鏈（雙）球菌 ， 球菌，成雙或成鏈，致人肺炎、小鼠敗血癥。有許多不同菌株，有莢膜者具致病性，菌落表面光滑 ，稱 S型；有的不形成莢膜，無致病性，菌落外觀粗糙 ， 稱 R型。 ： ? 動物試驗：小白鼠體內(nèi)加入活 R菌或死 S菌，小白鼠活；小白鼠體內(nèi)加入活 S菌，小白鼠死；小白鼠體內(nèi)加入活 R菌和熱死 S菌，小白鼠死，抽心血分離，發(fā)現(xiàn)有活的 S型細胞－轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。 ? 細菌培養(yǎng)試驗：熱死 S菌在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，不生長；活 R菌在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，長出 R菌；熱死 S菌和活 R菌在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，長出大量 R菌和 106S菌。 ? S型菌無細胞抽提液試驗：活 R菌加 S菌的無細胞抽提液，在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，長出大量的 R菌和少量的 S菌。 (a)無毒菌系 RII不使白鼠死亡，從鼠體內(nèi)分離仍得無(b)將 SIII加熱殺死，不使白鼠死亡，鼠體內(nèi)無有毒細菌； (c)混合活 RII和加熱殺死的 SIII， 使白鼠死亡，并在死鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)活的 SIII細胞 （一）轉(zhuǎn)化實驗 ? 以上實驗說明，加熱殺死的 S型細菌，在其細胞內(nèi)可能存在一種轉(zhuǎn)化物質(zhì)，它能通過某種方式進入 R型細胞，并使 R型細胞獲得穩(wěn)定的遺傳性狀。 （一）轉(zhuǎn)化實驗 ? 1944年，美 Avery等進行了離體條件轉(zhuǎn)化實驗。 ? 從活 S菌分離提純各種細胞成分 —— DNA，RNA， 蛋白質(zhì)，莢膜多糖等。 ? 將各組分逐個與活 R菌混合（①加 S菌的DNA； ② 加 S菌的 DNA及 DNA酶以外的酶；③加S菌的 DNA和 DNA酶 (分解 DNA)；④ 加 S菌的 RNA；⑤ 加 S菌的蛋白質(zhì)；⑥加 S菌的莢膜多糖），體外培養(yǎng)。 ? 結(jié)果：①、②長出 S菌；③、④、⑤、⑥只長 R菌。 自 SIII抽提的 DNA與活 R菌系細菌混合，少數(shù) R細胞轉(zhuǎn)化成 S細胞。加脫氧核糖核酸酶 (DNase)可阻止轉(zhuǎn)化作用 （一）轉(zhuǎn)化實驗 ? 上述結(jié)果說明： ? S菌 DNA將 R型轉(zhuǎn)化為 S型。 ? DNA純度越高，轉(zhuǎn)化效率越高。微量純DNA(6 108g)， 仍有轉(zhuǎn)化能力。 ? S菌轉(zhuǎn)移給 R菌的，不是某一遺傳性狀(如莢膜多糖 )本身，而是以 DNA為物質(zhì)基礎(chǔ)的遺傳信息。 （二）噬菌體感染實驗 ? 1952， ， 證明DNA是噬菌體遺傳物質(zhì)。 ? 以放射性 32PO34或 35SO24作為磷源或硫源培養(yǎng) ， 讓 T2噬菌體（只有核酸和蛋白質(zhì)）感染 ，獲得含 32PDNA核心的噬菌體或含 35S蛋白質(zhì)外殼的噬菌體。 ? 將 32PDNA噬菌體、 35S蛋白質(zhì)外殼噬菌體分別感染無放射性的 ，攪拌離心，觀察。發(fā)現(xiàn) DNA是噬菌體遺傳物質(zhì)。 ? 用含 32PDNA(核心 )的噬菌體作感染實驗 用含 35S蛋白質(zhì) (外殼 )的噬菌體作感染實驗 （三）植物病毒的重建實驗： ? 1956， 美 ， TMV（ RNA）和 HRV（ 與 TMV近緣的霍氏車前花葉病毒） 。 ? 將 TMV放在一定濃度的苯酚溶液中振蕩 ,使蛋白質(zhì)外殼與 RNA分離。 ? 分離的 RNA能感染煙草患典型癥狀 ,病斑中能分離出正常病毒粒子。 ? RNA裸露，缺乏蛋白質(zhì)衣殼保護，感染頻率低于正常 TMV粒子的感染頻率。 TMV重建實驗示意圖 (粗線 箭頭表示遺傳信息的去向 ) 二、證明核酸是遺傳變異 物質(zhì)的經(jīng)典實驗 ? 通過上述三個經(jīng)典實驗，確信無疑地得出結(jié)論 ， 只有核酸才是貯存遺傳信息的真正物質(zhì)。 ? （一）、細胞水平：核或核質(zhì)體 ? （ 二）、細胞核水平：核內(nèi)染色體 (核基因組 )，核外染色體（真核質(zhì)粒、質(zhì)體－線粒體、葉綠體；原核質(zhì)粒： F因子 性因子 、 R因子抗性因子 、 Col質(zhì)粒 產(chǎn)大腸桿菌素因子 、 Ti質(zhì)粒 誘癌 、巨大質(zhì)粒 固氮 、降解性質(zhì)粒 降解復雜物質(zhì) ） ? （三）、染色體水平 ： 數(shù)目，倍數(shù) ? （四）、核酸水平： DNA， RNA 三、遺傳物質(zhì)在細胞中的存在方式 ? （五）、基因水平 ： 具有特定核苷酸順序的核酸片段，具有自主復制能力的最小遺傳功能單位。相對分子量約為 105Da，10001500bp( 堿基對 )，每個細菌一般含有 5， 000—10， 000個基因。 三、遺傳物質(zhì)在細胞中的存在方式 ? （六）、密碼子水平：決定 3個核苷酸順序（ AA） 的片斷，遺傳的信息單位。 43=64＞ 20－ 23，出現(xiàn)一種以上密碼子編碼同一種氨基酸的現(xiàn)象。有些被用作“起讀” (AUG)或“終止”信號(UAA、 UGA和 UAG)。 ? （七）、核苷酸、堿基水平：最低突變單位或交換單位（ A、 G、 T、 C）。 三、遺傳物質(zhì)在細胞中的存在方式 ? 原核生物的基因調(diào)控系統(tǒng)是由操縱子（啟動基因、操縱基因、結(jié)構(gòu)基因）和調(diào)節(jié)基因組成。 ? 結(jié)構(gòu)基因決定多肽 (酶及結(jié)構(gòu)蛋白 )的 合成，操縱基因與結(jié)構(gòu)基因緊密連鎖在一起的，控制結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的開放或關(guān)閉。啟動基因是轉(zhuǎn)錄起始部位。 ? 調(diào)節(jié)基因一般與操縱子有一定間隔距離 (一般小于 100個堿基 )，調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因的活動。 三、遺傳物質(zhì)在細胞中的存在方式 ? 順序：啟動基因－操縱基因－結(jié)構(gòu)基－調(diào)節(jié)基因 ? 關(guān)閉轉(zhuǎn)錄：調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄出自己的 mRNA,經(jīng)翻譯產(chǎn)生阻遏蛋白 ,識別并附著在操縱基因上，相互作用使 DNA雙鏈無法分開，阻擋 RNA聚合酶沿著結(jié)構(gòu)基因移動。 ? 啟動轉(zhuǎn)錄：阻遏蛋白從操縱基因上解除；依賴于DNA的 RNA多聚酶附著在啟動基因上，通過操縱基因，沿著結(jié)構(gòu)基因移動，轉(zhuǎn)錄 mRNA。 三、遺傳物質(zhì)在細胞中的存在方式 ? 真核生物的基因：沒有操縱子結(jié)構(gòu)，存在不編碼序列和重復序列，轉(zhuǎn)錄與翻譯有空間分隔，基因之間被許多無編碼功能的內(nèi)含子阻隔。 四、原核生物的質(zhì)粒 ? cccDNA： 游離于染色體外，具有獨立復制能力的小型共價閉合環(huán)狀 DNA分子。 1984， 天藍色鏈霉菌等，發(fā)現(xiàn)線形質(zhì)粒。 ? 某些質(zhì)粒具有與核染色體整合和脫離的功能 ，如 F因子 ， 稱“附加體” 。 ? 分子量一般在 106～ 108Da， 大小約為 1%核基因組。攜帶染色體上沒有的基因 ， 賦予某些特殊功能，例如接合、產(chǎn)毒、抗藥、固氮、產(chǎn)特殊酶或降解有毒物質(zhì)等。 ? 質(zhì)粒消失不會造成菌體死亡 。 四、原核生物的質(zhì)粒 ? 質(zhì)粒復制與核染色體同步 ， 稱“嚴緊型復制控制”，細胞一般含 1～ 2個質(zhì)粒 ； 不同步 ， 稱“松弛型復制控制” ， 一般含 10～ 15個或更多。 ? 質(zhì)粒之間及質(zhì)粒與核染色體之間可以發(fā)生重組。 ? 少數(shù)質(zhì)?？梢栽诓煌觊g發(fā)生轉(zhuǎn)移 ， 如 F、 R等。 ? 遇吖啶類染料、絲裂霉素 C、 紫外線、利福平、重金屬離子或高溫等因素 ， 可使子代細胞中質(zhì)粒消失 。 四、原核生物的質(zhì)粒 ? （一）、 F因子、致育因子或性因子：。約等于 2%核染色體 DNA的小型 cccDNA。 分子量為 107Da， （ 千堿基對），其中有 1/3的基因與接合作用有關(guān)。 四、原核生物的質(zhì)粒 ? （二）、 R因子、 R質(zhì)粒： ? 多數(shù)由相連的兩個 DNA片段組成。其一稱 RTF質(zhì)粒 (抗性轉(zhuǎn)移因子 )，含有調(diào)節(jié) DNA復制和拷貝數(shù)的基因及轉(zhuǎn)移基因，有時還有四環(huán)素抗性基因 。11 106Da。 其二為 r質(zhì)粒（抗性決定質(zhì)粒），幾百萬至 100 106Da以上。含其他抗生素的抗性基因，例如抗青霉素 、 安比西林 、 氯霉素 、鏈霉素 、 卡那霉素和磺胺等基因。 一種可通過接合而轉(zhuǎn)移的 R因子的形成 (IS因子是轉(zhuǎn)座因子，可使 RTF質(zhì)粒和 r決定質(zhì)粒結(jié)合 ) 四、原核生物的質(zhì)粒 ? （三）、 Col因子、產(chǎn)大腸桿菌素因子。大腸桿菌素是 毒素，具有通過抑制復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯或能量代謝等，專一地殺死其他腸道細菌的功能。約 4～ 8 104Da。 ? 攜帶 Col因子的菌株，由于質(zhì)粒本身編碼一種免疫蛋白，從而對大腸桿菌素有免疫作用，不受其傷害。 四、原核生物的質(zhì)粒 ? （四）、 Ti質(zhì)粒、誘癌質(zhì)粒：大型，長 200kb。 ? 根癌土壤桿菌侵入到雙子葉植物細胞中， Ti質(zhì)粒片段與植物細胞核染色體組發(fā)生整合，破壞控制細胞分裂的激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)變成癌細胞。 ? 植物遺傳工程研究的重要載體。外源基因可借DNA重組技術(shù)插入到 Ti質(zhì)粒中，進一步整合到植物染色體上，改變遺傳性，培育優(yōu)良品