【正文】 ? 滅菌 (sterilization):用化學或物理方法殺死物料或設備中所有有生命物質(zhì)的過程 。 ? 消毒 (disinfection):用物理或化學方法殺死空氣 、 地表以及容器和器具表面的微生物 。 ? 除菌 (degermation): 用過濾方法除去空氣或液體中的微生物及其孢子 。 ? 防腐 (antisepsis): 用物理或化學方法殺死或抑制微生物的生長和繁殖 。 控制有害微生物主要有以下幾種措施： 殺滅病原微生物 殺滅一切微生物 比較項目 滅菌 消毒 防腐 化療 處理因素 強、理化因素 理、化因素 理、化因素 化學治療劑 處理對象 任何物體內(nèi)外 生物體表，酒、乳等 有機物體內(nèi)外 宿主體內(nèi) 微生物類型 一切微生物 有關病原菌 一切微生物 有關病原菌 對微生物作用 徹底殺滅 殺死或抑制 抑制或殺死 抑制或殺死 實例 加壓蒸氣滅菌，輻射滅菌、化學殺菌劑 70%酒精消毒、巴氏消毒法 冷藏、干燥、糖漬、鹽腌、缺氧、化學防腐劑 抗生素、磺胺藥、生物藥物素 ?什么是染菌？ ?發(fā)酵過程中除了生產(chǎn)菌以外，還有其它菌生長繁殖。 1） 由于雜菌污染 ， 使發(fā)酵培養(yǎng)基因雜菌的消耗而損失 ， 造成產(chǎn)率的下降； 2）由于雜菌所產(chǎn)生的某些代謝產(chǎn)物，或染菌后發(fā)酵液某些理化性質(zhì)的改變，使產(chǎn)物的提取變得困難，造成得率降低或使產(chǎn)品質(zhì)量下降； 3）污染的雜菌可能會分解產(chǎn)物而使生產(chǎn)失??； 雜菌污染的危害 4） 污染的雜菌大量繁殖 ， 會改變反應介質(zhì)的 pH， 從而使生物化學反應發(fā)生異常變化； 5） 發(fā)生噬菌體污染 ， 微生物細胞被裂解而使生產(chǎn)失敗等 。 A． 細菌 ? 谷氨酸 (棒狀桿菌 )： 發(fā)酵周期短 ， 培養(yǎng)基不太豐富 ， 較少染雜菌 ， 但 噬菌體 威脅大 。 ? 肌苷 （ 枯草桿菌 ） ： 缺陷型生產(chǎn)菌 ， 培養(yǎng)基豐富 ， 易染菌 ， 營養(yǎng)成分迅速被消耗 ， 嚴重抑制菌生長和合成代謝產(chǎn)物 。 B. 霉菌 ? PenG： 絕大多數(shù)雜菌都能直接產(chǎn)生青霉素酶 ，而另一些雜菌則可被青霉素誘導而產(chǎn)生青霉素酶 。不論在發(fā)酵前期 、 中期或后期 ， 染有能產(chǎn)生青霉素酶的雜菌 ， 都能使青霉素迅速破壞 。 ? 青霉素水解酶 上升 ， PenG迅速破壞 ， 發(fā)酵一無所獲 。 ? 檸檬酸 ： ， 不易染菌 ， 主要防止前期染菌 。 ?鏈霉素、四環(huán)素、紅霉素、卡那霉素 等雖不象青霉素發(fā)酵染菌那樣一無所得，但也會造成不同程度的危害。如雜菌大量消耗營養(yǎng)，干擾生產(chǎn)菌的正常代謝；改變 pH，降低產(chǎn)量。 ?灰黃霉素、制霉菌素、克念菌素 等抗生素抑制霉菌，對細菌幾乎沒有抑制和殺滅作用。 ? 青霉素：怕染細短產(chǎn)氣桿菌 ? 鏈霉素：怕染細短桿菌 、 假單孢桿菌和產(chǎn)氣桿菌 ? 四環(huán)素：怕染雙球菌 、 芽孢桿菌和莢膜桿菌 ? 檸檬酸：怕染青霉菌 ? 肌苷 （ 酸 ） ：怕染芽孢桿菌 ? 谷氨酸：怕染噬菌體 ， 易造成連續(xù)污染 ?C. 酵母菌 : 易污染細菌以及野生酵母菌 ?D. 疫苗生產(chǎn) :危害很大 ,現(xiàn)在疫苗多采用深層培養(yǎng)，這是一類不加提純而直接使用的產(chǎn)品，在其深層培養(yǎng)過程中，一旦污染雜菌，不論死菌、活菌或內(nèi)外毒素，都應全部廢棄。因此，發(fā)酵罐容積越大，污染雜菌后的損失也越大。 污染其它雜菌 ?有些雜菌會使生產(chǎn)菌 自溶 產(chǎn)生大量泡沫，即使添加消泡劑也無法控制逃液，影響發(fā)酵過程的通氣攪拌。 ?有的雜菌會使發(fā)酵液發(fā)臭、發(fā)酸，致使 pH下降 ，使不耐酸的產(chǎn)品破壞。 特別是染芽孢桿菌，由于芽孢耐熱，不易殺死，往往一次染菌后會反復染菌。 ?由于接種量較小，生產(chǎn)菌生長一開始不占優(yōu)勢，而且 培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富， 容易污染雜菌。 種子染菌對發(fā)酵危害極大，應嚴格控制種子染菌，如在此階段染菌，應將培養(yǎng)液全部廢棄。 （ 2）不同 發(fā)酵時期 染菌對發(fā)酵的影響 1）種子培養(yǎng)期染菌 2）發(fā)酵前期染菌 ?發(fā)酵前期最易染菌。 ?原因 發(fā)酵前期菌量不很多， 與雜菌沒有競爭優(yōu)勢； 且還未合成產(chǎn)物（抗生素）或產(chǎn)生很少， 抵御雜菌能力弱。 在這個時期要特別警惕以防止染菌的發(fā)生。 ?措施 如果前期染菌，且培養(yǎng)基養(yǎng)料消耗不多，可以重新滅菌，補加一些營養(yǎng)，重新接種再用。 ?發(fā)酵中期染菌，處理困難，危害很大。 3）發(fā)酵中期染菌 ?發(fā)酵中期染菌會嚴重干擾產(chǎn)生菌的代謝。雜菌大量產(chǎn)酸，培養(yǎng)液 pH下降；糖、氮消耗快，發(fā)酵液發(fā)粘，菌絲自溶，產(chǎn)物分泌減少或停止，有時甚至會使已產(chǎn)生的產(chǎn)物分解。有時也會使發(fā)酵液發(fā)臭，產(chǎn)生大量泡沫。 ?措施 降溫培養(yǎng)，減少補料，密切注意代謝變化情況。如果發(fā)酵單位到達一定水平可以提前放罐，或者抗生素生產(chǎn)中可以將高單位的發(fā)酵液輸送一部分到染菌罐，抑制雜菌。 4）發(fā)酵后期染菌 ?發(fā)酵后期發(fā)酵液內(nèi)已積累大量的產(chǎn)物，特別是抗生素，對雜菌有一定的抑制或殺滅能力。因此如果染菌不多，對生產(chǎn)影響不大。如果染菌嚴重，又破壞性較大，可以提前放罐。 （ 3）雜菌污染對發(fā)酵產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響 1）發(fā)酵染菌對過濾的影響 ?染菌的發(fā)酵液一般發(fā)粘，菌體大多數(shù)自溶，所以在發(fā)酵液過濾時不能或很難形成濾餅，導致 過濾困難 。 ?污染雜菌的種類對過濾的影響程度有差異，如污染霉菌時，影響較小，而污染細菌時很難過濾。由于過濾困難，過濾時間拉長， 影響發(fā)酵液儲罐和過濾設備的周轉(zhuǎn)使用， 破壞了生產(chǎn)平衡。染菌發(fā)酵液還會因過濾困難而 大幅度降低過濾收率， 直接影響提取總收率。 ? 絲狀菌發(fā)酵被產(chǎn)酸菌污染： pH不斷下降，菌絲大量自溶，發(fā)酵液粘度增加，過濾困難 預 處理方法： ①將發(fā)酵液加熱后再加助濾劑；②先加絮凝劑使蛋白質(zhì)凝聚后沉淀 ? 雜菌分泌較多蛋白質(zhì)雜質(zhì)時，對發(fā)酵后處理過程中采用溶媒萃取的提取工藝非常不利，使水相和溶媒之間極易發(fā)生乳化 ?染菌發(fā)酵液中含有比正常發(fā)酵液更多的水溶性蛋白和其它雜質(zhì)。 ?采用有機溶劑萃取的提煉工藝，則極易發(fā)生乳化，很難使水相和溶劑相分離，影響進一步提純。 ?采用直接用離子交換樹脂的提取工藝，如鏈霉素、慶大霉素，染菌后大量雜菌黏附在離子交換樹脂表面，或被離子交換樹脂吸附，大大降低離子交換樹脂的交換容量，而且有的雜菌很難用水沖洗干凈，洗脫時與產(chǎn)物一起進入洗脫液，影響進一步提純。 ? 顯微鏡檢查法 鏡檢出雜菌需要一定時間 ? 平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法：菌落 噬菌體檢查可采用雙層平板法：噬菌斑 ? 肉湯培養(yǎng)檢查法 ? 發(fā)酵過程的異?，F(xiàn)象判斷 ? DO2水平異常變化 ? pH異常變化 ? 尾氣 CO2異常變化 雙層平板法 底層平板（ 2％瓊脂培養(yǎng)基 10mL） 上層平板 上層培養(yǎng)基（ 1％瓊脂培養(yǎng)基 5mL） 宿主菌懸液（對數(shù)期菌液 ） 噬菌體試樣（合適稀釋液 ） 混勻 37℃ 10余 h 計數(shù)噬菌斑 ?溶解氧水平的異常變化 感染噬菌體，生產(chǎn)菌的作用受到抑制，溶氧濃度很快上升。 污染好氧性雜菌，溶解氧在短時間內(nèi)下降，并接近零值，長時間不能回升； 污染非好氧性雜菌，生產(chǎn)菌受到抑制，耗氧量減少，溶解氧升高。 1 2 ?尾氣中 CO2含量異常 污染雜菌，糖耗加快， CO2含量增加；感染噬菌體，糖耗減慢， CO2含