【正文】 LOGO 吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院 分子生物學(xué)教研室 講 師 孫 巍 Tel: 0431 85619369 202210 基因克隆、 克隆基因的表達 LOGO 熒光蛋白基因克隆貓 科學(xué)家復(fù)活冰凍死老鼠 修正基因蚊子防控疾病 基因轉(zhuǎn)換讓蝌蚪長出三顆眼睛 基因克隆胚芽造就健康嬰兒 基因克隆趣聞 LOGO 熒光蛋白基因克隆貓 具有熒光蛋白基因的克隆貓在紫外線照射下會變色 由韓國科學(xué)技術(shù)部公布的對比照片顯示出 3只具有熒光蛋白基因的克隆貓（上圖為普通光線照射下，下圖為紫外線照射下） LOGO 科學(xué)家復(fù)活冰凍死老鼠 一只老鼠死亡后被冷凍了16年之久 ,日本科學(xué)家從其體內(nèi)提取基因克隆了一只新老鼠 ,這是人類首次成功克隆冷凍動物。 LOGO 修正基因蚊子防控疾病 科學(xué)家把一種可防瘧疾的基因植入蚊子基因之中 ,對蚊子基因進行修正。 在實驗中 ,科學(xué)家們不僅僅在蚊子體內(nèi)植入了防瘧疾基因 ,還植入了另一種可以使蚊子眼睛發(fā)出熒光的基因。這樣 ,科學(xué)家就可以很容易識別它們。 LOGO 基因轉(zhuǎn)換讓蝌蚪長出三顆眼睛 2022年 ,英國科學(xué)家在實驗室中利用基因轉(zhuǎn)換技術(shù)成功地在蝌蚪頭部培育出第三顆眼球。這個消息對盲人來說是一個天大的喜訊。利用這種技術(shù) ,干細胞科學(xué)家們真的有可能實現(xiàn)他們再造眼球的夢想。 LOGO 基因克隆胚芽造就健康嬰兒 基因的秘密隨著科技的日益發(fā)達而被逐漸揭開。血友病、色盲、白化病 …… 這些遺傳病困擾著一個又一個家庭，也激勵著一代又一代科學(xué)家為之奮斗。 LOGO 分子生物學(xué)關(guān)鍵的技術(shù)突破： DNA重組技術(shù) 1972年， 世界上第一個重組 DNA分子誕生 Paul Berg a biochemistry at Stanford 猿猴病毒 DNA ?噬菌體 DNA 限制性內(nèi)切酶 限制性內(nèi)切酶 DNA連接酶 重組 DNA分子 1980年， 獲諾貝爾化學(xué)獎 ? LOGO 克?。和ㄟ^ 無性繁殖 過程所產(chǎn)生的與親代 完全相同的子代群體。 molecule Cell colony anism DNA clone 基因克隆 : 是指來自不同生物的 基因 同有自主復(fù)制能力的 載體 DNA在 體外 人工連接，構(gòu)建成新的重組 DNA，然后送入受體生物中去表達，從而產(chǎn)生遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移和重新組合。 LOGO 一、目的 DNA的 分 離獲?。ǚ郑?； 二、載體的選 擇 與準(zhǔn)備（擇）； 三、目的 DNA與載體連 接 （接）； 四、重組 DNA轉(zhuǎn) 入受體細胞（轉(zhuǎn)）； 五、重組體的 篩 選與鑒定（篩）。 DNA克隆的過程包括五個基本部分： LOGO 一、 目的 DNA的分離獲取（分） 分離獲取目的 DNA有多種方法： (一 ) PCR——待擴增目的基因兩端序列已知 （據(jù)此設(shè)計引物） (二 ) 基因文庫 ——先構(gòu)建，后篩選 (三 )化學(xué)合成法 ——直接合成目的 DNA（序列已知、片段較短） LOGO 隨機打碎： 物理方法 缺點：難以重復(fù)；獲得的 DNA量少等。 LOGO ? 限制性核酸內(nèi)切酶 的發(fā)現(xiàn) 1970年， 第一個限制性核酸內(nèi)切酶 定點 剪切 DNA 操作 DNA 1978年， 獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎 限制性核酸內(nèi)切酶 ——用于切割 DNA LOGO 限制性核酸內(nèi)切酶 Restriction endonuclease ?可分為 Ⅰ 、 Ⅱ 、 Ⅲ 型，分子生物學(xué)中通常使用的是 Ⅱ 型 ： 能在 DNA雙鏈內(nèi)部的 特異 位點識別并切割 DNA，“ 分子剪刀 ” GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam HⅠ 核酸水解酶，裂解磷酸二酯鍵。 LOGO Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶具有一些共性和特性： 1. 具有特定的識別和切割位點 限制性內(nèi)切酶 識別位點 限制性內(nèi)切酶 識別位點 Apa I GGGCC’C C’CCGGG Sma I CCC’GGG GGG’CCC BamH I G’GATCC CCTAG’G Sau 3A I GATC’ ’CTAG Pst I CTGCA’G G’ACGTC Not I GC’GGCCGC CGCCGG’CG EcoR I G’AATTC CTTAA’G Sfi I GGCCNNNN’NGGCC CCGGN’NNNNCCGG II型限制性內(nèi)切酶的識別位點舉例（ 39。示切割位點） 識別位點通常為 6或 4堿基序列 LOGO 2. 識別的核苷酸序列通常為回文結(jié)構(gòu)（ palindrome） 兩條核苷酸鏈中，從 5’到 3’方向的核苷酸序列完全一致 Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶具有一些共性和特性： LOGO 3. 切割雙鏈 DNA分子后產(chǎn)生黏端或平端 Bam HⅠ GTC CAG G CCTAG GATCC G + GGATCC CCTAGG HindⅡ GTCGAC CAGCTG GAC CTG + 平端切口 黏端切口 （ sticky end） （ blunt end） Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶具有一些共性和特性： LOGO 粘性末端又可分為兩種： 1） 5?端突出 2） 3?端突出 ………CTGCA OH G……… ………G HOACGTC……… 5? 3? 5? 3? 5? 5? PstI ………CTGCA G……… …… C ACGTC……… 5? 5? 3? 3? ………G OH AATTC……. ………CTTAA HOG…… 5? 3? 5? 5? 5? 3? EcoRI ………GAATTC……… …… CTTAAG……… 5? 3? 5? 3? LOGO 4. 不同的酶可以產(chǎn)生同樣的末端 同尾酶 （ isocaudarner）： 有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的黏端，這樣的酶彼此互稱為同尾酶。這兩個相同的黏端稱為配伍末端 (patible end)。 Bam HⅠ Bg lⅡ GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGA G CCTAG GATCC G + + A TCTAG GATCT A互連后？ Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶具有一些共性和特性： LOGO 5. 不同的酶可以識別同一個序列 同工異源酶（ isoschizomer）或同裂酶 能識別同一序列（切割位點可同或不同）但來源不同的兩種酶。 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + BstⅠ CCCGGG GGGCCC C CCCGG CCGGG G + XmaⅠ CCCGGG GGGCCC CCC GGG GGG CCC + SmaⅠ 為 DNA操作增加了酶的可選余地 Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶具有一些共性和特性： LOGO 6. 切割會受其他因素的影響 ? 通常不能切割在識別位點內(nèi)有特異堿基甲基化的序列。 ? 緩沖液或環(huán)境溫度也會影響一些酶的特異性。 如， EcoR I在正常情況下識別“ GAATTC”序列，但在甘油濃度大于 5%（ v/v）或反應(yīng)溫度較低時識別序列可變?yōu)椤?AATT”或“ 嘌呤嘌呤 AT嘧啶嘧啶 ”，這種現(xiàn)象稱為 星號活性 （ star activity），以 EcoR I*表示。 Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶具有一些共性和特性： LOGO M 6. 切割會受其他因素的影響 4. 不同的酶可以產(chǎn)生同樣的末端 3. 切割雙鏈 DNA分子后產(chǎn)生黏端或平端 2. 識別的核苷酸序列通常為回文結(jié)構(gòu)（ palindrome） 1. 具有特定的識別和切割位點 Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶具有一些共性和特性： 在 DNA雙鏈內(nèi)部的特異位點識別并切割 DNA LOGO 文庫法： 一個細胞只接受一個重組 DNA分子 一般一個載體只攜帶一段外源 DNA 單克隆 LOGO 基因組 DNA文庫（ genomic DNA library）： 包含某一個生物細胞或組織全部基因組 DNA序列的隨機克隆群體，以 DNA片段的形式貯存了所有的基因組 DNA信息。 如何從文庫中釣取基因？ LOGO 用 帶有標(biāo)記的 、 已知序列的核酸片段 (單鏈RNA或 DNA)作為 探針 ，與待測 DNA或 RNA 樣品進行核酸分子雜交， 來檢測被測樣品中是否有與探針序列同源的目標(biāo)序列，以及目標(biāo)序列的量。 LOGO 轉(zhuǎn)膜、 變性、 封閉、 加入變性的探針、 雜交、 洗滌、 檢測雜交體。 LOGO 如何實現(xiàn)特異性的獲得目的基因？ LOGO 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) Polymerase Chain Reaction, PCR 體外高效 特異性 的擴增目的 DNA片段 LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO 1 2 3 4 5 22 55 72 94 時間（ min） 溫度 （ ℃ ） PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 適溫延伸 3 高溫變性 1 低溫退火 2 重復(fù) 1~3步 25~30輪 目的 DNA片段 擴增 100萬倍以上 DNA