【正文】 LOGO 吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院 分子生物學(xué)教研室 講 師 孫 巍 Tel: 0431 85619369 202210 基因克隆、 克隆基因的表達(dá) LOGO 熒光蛋白基因克隆貓 科學(xué)家復(fù)活冰凍死老鼠 修正基因蚊子防控疾病 基因轉(zhuǎn)換讓蝌蚪長(zhǎng)出三顆眼睛 基因克隆胚芽造就健康嬰兒 基因克隆趣聞 LOGO 熒光蛋白基因克隆貓 具有熒光蛋白基因的克隆貓?jiān)谧贤饩€照射下會(huì)變色 由韓國(guó)科學(xué)技術(shù)部公布的對(duì)比照片顯示出 3只具有熒光蛋白基因的克隆貓（上圖為普通光線照射下，下圖為紫外線照射下） LOGO 科學(xué)家復(fù)活冰凍死老鼠 一只老鼠死亡后被冷凍了16年之久 ,日本科學(xué)家從其體內(nèi)提取基因克隆了一只新老鼠 ,這是人類首次成功克隆冷凍動(dòng)物。 LOGO 修正基因蚊子防控疾病 科學(xué)家把一種可防瘧疾的基因植入蚊子基因之中 ,對(duì)蚊子基因進(jìn)行修正。 在實(shí)驗(yàn)中 ,科學(xué)家們不僅僅在蚊子體內(nèi)植入了防瘧疾基因 ,還植入了另一種可以使蚊子眼睛發(fā)出熒光的基因。這樣 ,科學(xué)家就可以很容易識(shí)別它們。 LOGO 基因轉(zhuǎn)換讓蝌蚪長(zhǎng)出三顆眼睛 2022年 ,英國(guó)科學(xué)家在實(shí)驗(yàn)室中利用基因轉(zhuǎn)換技術(shù)成功地在蝌蚪頭部培育出第三顆眼球。這個(gè)消息對(duì)盲人來(lái)說(shuō)是一個(gè)天大的喜訊。利用這種技術(shù) ,干細(xì)胞科學(xué)家們真的有可能實(shí)現(xiàn)他們?cè)僭煅矍虻膲?mèng)想。 LOGO 基因克隆胚芽造就健康嬰兒 基因的秘密隨著科技的日益發(fā)達(dá)而被逐漸揭開。血友病、色盲、白化病 …… 這些遺傳病困擾著一個(gè)又一個(gè)家庭，也激勵(lì)著一代又一代科學(xué)家為之奮斗。 LOGO 分子生物學(xué)關(guān)鍵的技術(shù)突破： DNA重組技術(shù) 1972年， 世界上第一個(gè)重組 DNA分子誕生 Paul Berg a biochemistry at Stanford 猿猴病毒 DNA ?噬菌體 DNA 限制性內(nèi)切酶 限制性內(nèi)切酶 DNA連接酶 重組 DNA分子 1980年， 獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) ? LOGO 克?。和ㄟ^ 無(wú)性繁殖 過程所產(chǎn)生的與親代 完全相同的子代群體。 molecule Cell colony anism DNA clone 基因克隆 : 是指來(lái)自不同生物的 基因 同有自主復(fù)制能力的 載體 DNA在 體外 人工連接，構(gòu)建成新的重組 DNA，然后送入受體生物中去表達(dá)，從而產(chǎn)生遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移和重新組合。 LOGO 一、目的 DNA的 分 離獲?。ǚ郑?； 二、載體的選 擇 與準(zhǔn)備（擇）； 三、目的 DNA與載體連 接 （接）； 四、重組 DNA轉(zhuǎn) 入受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)）； 五、重組體的 篩 選與鑒定（篩）。 DNA克隆的過程包括五個(gè)基本部分： LOGO 一、 目的 DNA的分離獲?。ǚ郑? 分離獲取目的 DNA有多種方法： (一 ) PCR——待擴(kuò)增目的基因兩端序列已知 （據(jù)此設(shè)計(jì)引物） (二 ) 基因文庫(kù) ——先構(gòu)建，后篩選 (三 )化學(xué)合成法 ——直接合成目的 DNA（序列已知、片段較短） LOGO 隨機(jī)打碎： 物理方法 缺點(diǎn)：難以重復(fù)；獲得的 DNA量少等。 LOGO ? 限制性核酸內(nèi)切酶 的發(fā)現(xiàn) 1970年， 第一個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶 定點(diǎn) 剪切 DNA 操作 DNA 1978年， 獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) 限制性核酸內(nèi)切酶 ——用于切割 DNA LOGO 限制性核酸內(nèi)切酶 Restriction endonuclease ?可分為 Ⅰ 、 Ⅱ 、 Ⅲ 型，分子生物學(xué)中通常使用的是 Ⅱ 型 ： 能在 DNA雙鏈內(nèi)部的 特異 位點(diǎn)識(shí)別并切割 DNA，“ 分子剪刀 ” GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam HⅠ 核酸水解酶，裂解磷酸二酯鍵。 LOGO Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶具有一些共性和特性： 1. 具有特定的識(shí)別和切割位點(diǎn) 限制性內(nèi)切酶 識(shí)別位點(diǎn) 限制性內(nèi)切酶 識(shí)別位點(diǎn) Apa I GGGCC’C C’CCGGG Sma I CCC’GGG GGG’CCC BamH I G’GATCC CCTAG’G Sau 3A I GATC’ ’CTAG Pst I CTGCA’G G’ACGTC Not I GC’GGCCGC CGCCGG’CG EcoR I G’AATTC CTTAA’G Sfi I GGCCNNNN’NGGCC CCGGN’NNNNCCGG II型限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)舉例（ 39。示切割位點(diǎn)） 識(shí)別位點(diǎn)通常為 6或 4堿基序列 LOGO 2. 識(shí)別的核苷酸序列通常為回文結(jié)構(gòu)（ palindrome） 兩條核苷酸鏈中，從 5’到 3’方向的核苷酸序列完全一致 Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶具有一些共性和特性： LOGO 3. 切割雙鏈 DNA分子后產(chǎn)生黏端或平端 Bam HⅠ GTC CAG G CCTAG GATCC G + GGATCC CCTAGG HindⅡ GTCGAC CAGCTG GAC CTG + 平端切口 黏端切口 （ sticky end） （ blunt end） Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶具有一些共性和特性： LOGO 粘性末端又可分為兩種： 1） 5?端突出 2） 3?端突出 ………CTGCA OH G……… ………G HOACGTC……… 5? 3? 5? 3? 5? 5? PstI ………CTGCA G……… …… C ACGTC……… 5? 5? 3? 3? ………G OH AATTC……. ………CTTAA HOG…… 5? 3? 5? 5? 5? 3? EcoRI ………GAATTC……… …… CTTAAG……… 5? 3? 5? 3? LOGO 4. 不同的酶可以產(chǎn)生同樣的末端 同尾酶 （ isocaudarner）： 有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的黏端，這樣的酶彼此互稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的黏端稱為配伍末端 (patible end)。 Bam HⅠ Bg lⅡ GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGA G CCTAG GATCC G + + A TCTAG GATCT A互連后？ Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶具有一些共性和特性： LOGO 5. 不同的酶可以識(shí)別同一個(gè)序列 同工異源酶（ isoschizomer）或同裂酶 能識(shí)別同一序列（切割位點(diǎn)可同或不同）但來(lái)源不同的兩種酶。 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + BstⅠ CCCGGG GGGCCC C CCCGG CCGGG G + XmaⅠ CCCGGG GGGCCC CCC GGG GGG CCC + SmaⅠ 為 DNA操作增加了酶的可選余地 Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶具有一些共性和特性： LOGO 6. 切割會(huì)受其他因素的影響 ? 通常不能切割在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)有特異堿基甲基化的序列。 ? 緩沖液或環(huán)境溫度也會(huì)影響一些酶的特異性。 如， EcoR I在正常情況下識(shí)別“ GAATTC”序列，但在甘油濃度大于 5%（ v/v）或反應(yīng)溫度較低時(shí)識(shí)別序列可變?yōu)椤?AATT”或“ 嘌呤嘌呤 AT嘧啶嘧啶 ”，這種現(xiàn)象稱為 星號(hào)活性 （ star activity），以 EcoR I*表示。 Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶具有一些共性和特性： LOGO M 6. 切割會(huì)受其他因素的影響 4. 不同的酶可以產(chǎn)生同樣的末端 3. 切割雙鏈 DNA分子后產(chǎn)生黏端或平端 2. 識(shí)別的核苷酸序列通常為回文結(jié)構(gòu)（ palindrome） 1. 具有特定的識(shí)別和切割位點(diǎn) Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶具有一些共性和特性： 在 DNA雙鏈內(nèi)部的特異位點(diǎn)識(shí)別并切割 DNA LOGO 文庫(kù)法： 一個(gè)細(xì)胞只接受一個(gè)重組 DNA分子 一般一個(gè)載體只攜帶一段外源 DNA 單克隆 LOGO 基因組 DNA文庫(kù)（ genomic DNA library）： 包含某一個(gè)生物細(xì)胞或組織全部基因組 DNA序列的隨機(jī)克隆群體，以 DNA片段的形式貯存了所有的基因組 DNA信息。 如何從文庫(kù)中釣取基因？ LOGO 用 帶有標(biāo)記的 、 已知序列的核酸片段 (單鏈RNA或 DNA)作為 探針 ，與待測(cè) DNA或 RNA 樣品進(jìn)行核酸分子雜交， 來(lái)檢測(cè)被測(cè)樣品中是否有與探針序列同源的目標(biāo)序列，以及目標(biāo)序列的量。 LOGO 轉(zhuǎn)膜、 變性、 封閉、 加入變性的探針、 雜交、 洗滌、 檢測(cè)雜交體。 LOGO 如何實(shí)現(xiàn)特異性的獲得目的基因？ LOGO 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) Polymerase Chain Reaction, PCR 體外高效 特異性 的擴(kuò)增目的 DNA片段 LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO 1 2 3 4 5 22 55 72 94 時(shí)間（ min） 溫度 （ ℃ ） PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點(diǎn) 適溫延伸 3 高溫變性 1 低溫退火 2 重復(fù) 1~3步 25~30輪 目的 DNA片段 擴(kuò)增 100萬(wàn)倍以上 DNA