【正文】 分類(lèi)號(hào) S511 學(xué) 號(hào) 2008201008 博士學(xué)位論文水稻顯性矮稈基因Epidf的圖位克隆、表觀修飾特征分析及功能研究張 立 國(guó)指導(dǎo)教師萬(wàn)建民 教授專業(yè)名稱遺 傳 學(xué)研究方向水稻分子遺傳答辯日期二○一二年十二月113 / 129POSITIONAL CLONING, EPIGENETIC MODIFICATION AND FUNCTIONAL ANALYSES OF A DOMINANT DWARF GENE OF Epidf IN RICE (ORYZA SATIVA L.)ByZhang LiguoA dissertation submitted toNanjing Agricultural University In Partial Fulfillment of the Requirements for Doctoral Degree SupervisedByProfessor Wan JianminDepartment of Crop Genetics and Breeding Nanjing Agricultural University Nanjing 210095, December 2012原 創(chuàng) 性 聲 明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的作品成果。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者（需親筆）簽名： 年 月 日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編學(xué)位論文。保密□，在 年解密后適用本授權(quán)書(shū)。本學(xué)位論文屬于不保密□。 （請(qǐng)?jiān)谝陨戏娇騼?nèi)打“√”）學(xué)位論文作者（需親筆）簽名： 年 月 日導(dǎo)師（需親筆）簽名： 年 月 日目 錄摘 要 IABSTRACT III縮略詞 V第一章 文獻(xiàn)綜述 11 水稻株高的研究概況 1 水稻矮化突變體的遺傳研究進(jìn)展 1 水稻矮化機(jī)制的研究進(jìn)展 2 水稻顯性矮稈突變體的研究進(jìn)展 62 植物表觀遺傳調(diào)控的分子機(jī)制 7 表觀遺傳學(xué)的定義和研究?jī)?nèi)容 7 DNA甲基化 7 組蛋白修飾 13 表觀遺傳學(xué)的研究方法 17 表觀等位基因的克隆 193 PcG蛋白介導(dǎo)的基因沉默與植物發(fā)育 20 PcG蛋白復(fù)合體的組成和分類(lèi) 21 PcG蛋白與TRX蛋白的相互拮抗 22 PcG蛋白介導(dǎo)的H3K27me3修飾的建立、維持以及識(shí)別 23 PcG蛋白對(duì)植物發(fā)育的調(diào)控 254 本研究的目的和意義 27第二章 水稻Epidf突變體的表型及遺傳分析 291 材料與方法 29 實(shí)驗(yàn)材料與田間種植 29 Epidf降稈能力調(diào)查 30 Epidf花器官突變、花粉育性以及結(jié)實(shí)率調(diào)查 30 Epidf遺傳規(guī)律和回復(fù)突變調(diào)查 302 結(jié)果與分析 30 Epidf表型分析 30 Epidf花器官變異及育性分析 31 Epidf降稈能力分析 34 Epidf遺傳規(guī)律分析 343 討論 37 Epidf具有潛在的育種利用價(jià)值 37 Epidf遺傳穩(wěn)定但存在低頻率的回復(fù)突變 38第三章 水稻顯性矮稈基因Epidf的圖位克隆及轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證 391 材料與方法 39 實(shí)驗(yàn)材料與田間種植 39 DNA提取 40 PCR分析 40 分子標(biāo)記設(shè)計(jì) 41 基因定位 41 候選基因預(yù)測(cè)和測(cè)序 42 RNA提取、RTPCR及Realtime PCR 42 轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)載體的構(gòu)建 42 轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建 43 農(nóng)稈菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化 43 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的鑒定 432 結(jié)果與分析 44 初定位和精細(xì)定位 44 候選基因分析 45 候選基因的測(cè)序和表達(dá)分析 46 轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證 473 討論 49 Epidf突變表型來(lái)自FIE1基因的異位表達(dá) 49 FIE1異位表達(dá)可能是由表觀突變導(dǎo)致的 50第四章 水稻FIE1基因的表觀遺傳修飾及功能分析 511 材料與方法 52 DNA甲基化分析 52 亞硫酸鹽法DNA甲基化測(cè)序 53 染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP） 53 生物信息學(xué)分析 53 胚乳RNA提取、RTPCR及Realtime PCR 53 印記分析 54 酵母雙雜交分析 54 Microarray分析 552 結(jié)果與分析 55 FIE1基因DNA甲基化分析 55 FIE1基因位點(diǎn)組蛋白H3K9me2和H3K4me3分析 60 FIE1基因結(jié)構(gòu)及蛋白同源分析 61 FIE1基因表達(dá)模式分析 64 FIE1基因印記分析 66 FIE1蛋白與水稻E（z）類(lèi)蛋白互作 68 FIE1基因異位表達(dá)對(duì)靶基因H3K27me3修飾的影響 693 討論 71 Epidf是水稻中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)DNA去甲基化表觀突變體 71 FIE1的胚乳特異性表達(dá)和印記模式受DNA甲基化調(diào)控 72 FIE1蛋白參與PcG蛋白復(fù)合體PRC2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制 73 水稻中PRC2介導(dǎo)的H3K27me3修飾途徑受H3K9me2的調(diào)控 74第五章 全文討論與結(jié)論 751 討論 75 Epidf具有自身的表觀遺傳學(xué)特征 75 表觀遺傳修飾對(duì)水稻兩個(gè)FIE基因的功能分化起重要作用 75 水稻H3K27me3的正常功能依賴于H3K9me2對(duì)FIE1的轉(zhuǎn)錄抑制 762 結(jié)論 76 Epidf是一個(gè)降稈能力較強(qiáng)的顯性矮稈突變體 76 Epidf的表型是由FIE1基因的表觀遺傳突變導(dǎo)致的 76 FIE1的表達(dá)模式和印記特征受表觀遺傳修飾調(diào)控 77 FIE1參與PRC2介導(dǎo)的基因沉默 783 本文創(chuàng)新之處 78參考文獻(xiàn) 79附 錄 97在讀期間發(fā)表的論文 109致 謝 111水稻顯性矮稈基因Epidf的圖位克隆、表觀修飾特征分析及功能研究摘 要株高是與產(chǎn)量相關(guān)的重要農(nóng)藝性狀，株高超過(guò)一定范圍容易引起倒伏而減產(chǎn)，矮稈不僅有利于抗倒伏，而且耐貧瘠，有利于提高產(chǎn)量。20世紀(jì)50年代末開(kāi)始的矮化育種，使水稻株高降低至半矮稈，水稻單產(chǎn)獲得了第一次飛躍，成為“綠色革命”的標(biāo)志性成就之一。目前正在進(jìn)行的超級(jí)稻育種主要利用理想株型和秈粳亞種間雜種優(yōu)勢(shì)以期水稻單產(chǎn)得到進(jìn)一步提高。迄今水稻育種中利用的矮稈基因都是隱性基因，雜交水稻育種中隱性矮稈基因的使用往往要求雙親必須具有同一矮稈基因，這就限制了在更廣泛的資源中選擇有利親本。但是如果利用顯性矮稈基因，則能夠使水稻種質(zhì)資源得到更有效的利用和縮短育種時(shí)間。因此發(fā)掘新的水稻株高控制基因特別是顯性矮稈基因，對(duì)進(jìn)一步提高水稻單產(chǎn)具有重要意義。本研究對(duì)顯性矮稈突變體Epidf進(jìn)行了系統(tǒng)的表型考察和降稈能力分析，并對(duì)產(chǎn)生矮化的分子機(jī)制進(jìn)行了深入研究。主要研究結(jié)果如下：（1）Epidf從苗期至成熟期表現(xiàn)矮化，并且與野生型雜交F1表現(xiàn)類(lèi)似突變體的表型，因此，Epidf屬于顯性矮稈突變體。Epidf與秈稻品種培矮64正反交F1株高介于兩者之間，F(xiàn)2代分離群體中高株和矮株數(shù)比例接近1：3，表明Epidf表型是由單顯性核基因控制。將Epidf與3個(gè)秈稻品種和3個(gè)粳稻品種雜交，%%之間，表明Epidf具有較強(qiáng)的降稈能力，有望在水稻秈粳交雜種優(yōu)勢(shì)利用育種中得到應(yīng)用。（2）利用圖位克隆方法將突變基因精細(xì)定位在49kb區(qū)域內(nèi)，但并未發(fā)現(xiàn)DNA序列突變，卻發(fā)現(xiàn)其中的ORF5在突變體中表達(dá)強(qiáng)烈，而在野生型中沉默。Epidf還存在另外一個(gè)特征，即雖然表現(xiàn)遺傳穩(wěn)定但存在低水平的回復(fù)突變頻率，因此ORF5的異位表達(dá)可能是由表觀遺傳變異引起的。DNA甲基化測(cè)序結(jié)果表明FIE15’端發(fā)生了DNA去甲基化，這與FIE1的異位表達(dá)是一致的。盡管FIE1在回復(fù)突變株中保持沉默，但DNA甲基化并未恢復(fù)到野生型水平，發(fā)生恢復(fù)的位點(diǎn)主要集中在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近和第3個(gè)外顯子。另外，Epidf中FIE15’端H3K9me2水平下降，而H3K4me3水平上升，這與FIE1基因的異位表達(dá)和DNA去甲基化是一致的。因此，Epidf是一個(gè)表觀遺傳突變體，這為研究表觀遺傳修飾對(duì)單子葉植物尤其是重要作物的生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控提供了重要材料。（3）FIE1是胚乳特異性表達(dá)的基因，并且具有僅母本表達(dá)的印記特征。FIE1在葉片、莖和幼穗中存在高水平的DNA甲基化，而在受精后第9和12天的胚乳中甲基化水平嚴(yán)重降低，并且F1胚乳中母本FIE1的DNA甲基化水平比父本低很多，因此FIE1的表達(dá)模式和印記特征受DNA甲基化調(diào)控。與擬南芥僅有一個(gè)FIE基因不同，水稻含有兩個(gè)FIE基因，另一個(gè)FIE基因FIE2是組成性表達(dá)的，因此我們推測(cè)水稻基因組復(fù)制以及隨后的進(jìn)化過(guò)程中，表觀遺傳修飾對(duì)兩個(gè)FIE基因的功能分化起了重要作用。（4）酵母雙雜交結(jié)果表明FIE1與iEZ1以及CLF互作，表明FIE1參與水稻中PRC2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制?；蛐酒治霭l(fā)現(xiàn)Epidf中有305個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生了改變，其中222個(gè)基因下調(diào)，83個(gè)基因上調(diào)。利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)這些表達(dá)量改變的基因同時(shí)伴隨著H3K27me3修飾的改變。因此，F(xiàn)IE1的異位表達(dá)導(dǎo)致靶基因H3K27me3修飾水平和表達(dá)量的改變，從而使Epidf表現(xiàn)突變表型。（5）H3K9me2和H3K27me3是與轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)非常保守的兩種表觀遺傳修飾， H3K9me2主要集中在異染色質(zhì)，起抑制轉(zhuǎn)座子和逆轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)座的功能；H3K27me3基本存在于常染色質(zhì)，起抑制基因轉(zhuǎn)錄和維持細(xì)胞記憶的功能。染色質(zhì)免疫共沉淀分析表明FIE15’端存在高水平的H3K9me2，而Epidf中H3K9me2水平降低引起FIE1異位表達(dá)和基因組水平上H3K27me3分布異常，從而導(dǎo)致水稻發(fā)育缺陷。因此，H3K9me2控制的FIE1轉(zhuǎn)錄抑制對(duì)水稻中H3K27me3的正常功能是必需的。關(guān)鍵詞：水稻；顯性矮化；FIE1；表觀遺傳突變；H3K9me2；H3K27me3POSITIONAL CLONING, EPIGENETIC MODIFICATION AND FUNCTIONAL ANALYSES OF A DOMINANT DWARF GENE OF Epidf IN RICE (ORYZA SATIVA L.)ABSTRACTPlant height is an agronomically important trait for grain yield，the higher plant is easy to be lodging and decreasing yield, whereas dwarf plant has a great harvest index because of improved lodging resistance and increasing use of nitrogen fertilizers. Dwarfism breeding resulted in the first qualitative leap for yield increase, which was well known as “green revolution”. The objective of super rice breeding is to make a breakthrough in rice yield by using ideotype and intersubspecific heterosis. Whereas all the dwarf genes used in rice breeding is recessive by now, thus both the male and female parents must carry the same recessive dwarf gene in hybrid rice breeding process. But when one parent carries a dominant dwarf allele, the germplasm of the other parent would not be restricted. Therefore, isolation new genes that control plant height especially the dominant dwarf genes is crucial for improving rice yield. In this study, we systematacially characterized a dominant dwarf mutant Epidf and analyzed the molecular mechanism for dwarfism.The main results as follows:(1) From seedling to mature stage, Epidf showe