【正文】 1 2020 年度教育部重點實驗室總結報告 實驗室名稱：分子心血管學教育部重點實驗室 實驗室主任： 王憲 實驗室副主任：張幼怡 劉國慶 朱毅 學術委員會主任： 楊寶峰 填報人： 嚴曉蘭 依托單位名稱：北京大學 通訊地址：北京海淀區(qū) 學院路 38 號 郵政編碼： 100191 聯(lián)系電話： 01082801443 Email 地址： 1 研究水平與貢獻 本重點 實驗室 在 2020 年度 注重培養(yǎng)科研人才，促進學科發(fā)展，積極參與國內外交流， 加強 了 實驗室基礎與臨床科研力量。各 課題組 緊密結合重大心血管 疾病臨床問題 進一步深入開展轉化醫(yī)學 研究 ，在基礎與臨床研究結合方面取得了 顯著 成績， 在免疫炎癥與代謝性血管病變、心血管病發(fā)病機制等研究方面取得了較好的成果，在 有影響的 國際學術期刊（如： PNAS、Hepatology、 Circ Res）發(fā)表 了多篇論文。在 臨床研究 方面 開展了一系列的研究工作 ，如 心力衰竭早期診斷和預警相關生物標志物研究 、 急性冠脈綜合征合并 II 型糖尿病患者再發(fā)事件的生物標志物預警因素研究 、 房 顫藥物治療安全性和有效性的比較效果研究 、 應用高通量基因芯片尋找 和 鑒定中國人群心肌梗死相關基因的病例對照研究 ， 以 及 高 密度脂蛋白氧化及其蛋白質組 分 變化與冠心病發(fā)病的關系 研究 等 。這些研究工作 在學校 985 項目支持下已經啟動 ， 并 結合了 醫(yī)學生物信息學方法， 取得了較多進展， 在國際刊物 上 發(fā)表 了多篇 論文。 本年度 發(fā)表論文共計 80篇 其中被 SCI 收錄 70 篇， IF=10 為 1篇、 IF 510 為 20篇、IF 35 為 19 篇、 IF?3為 30篇、總 IF ，平均 。 并出版 專著 2本 。 本 重點實驗室 PI 的學術水平得到國際學術界的認可和重視，有多人被選為多種重要國際學術組織主席、副主席、秘書長；多人應邀在國際期刊上寫綜述 ，或 受聘為國際刊物編委；多 人 在多種國際大會上獲獎；并與多個國際知名的心血管研究院、所開展了廣泛的合作。本年度實驗室的多項課題研究獲得了國家重大、重點項目的支持，包括基金委國際合作項目和重點項目、科技部重大科學計劃 。共計 獲得 基金項目 28 項（ 萬）。其中，國際合作 2 項（ 601 萬）， 國家自然基金重點項目 3 項（ 740 萬），國家自然基金面上項目 13 項 (422 萬 )，北京市項目 2 項（ 41萬 ） ， 985 項目 3 項（ 萬）， 其他 5 項（ 萬）。 獲 得 新增基金項目 26 項（ 3652萬） 。其中， “ 973” 5 項（ 1333 萬）， 國家自然青年科學基金項目 4 項（ 90 萬 ） ，國家自然基金重點項目 2 項（ 590 萬），國家自然基金面上項目 6 項 (370 萬 ), 教育部博導類項目 2 項（ 24 萬），北京市項目 3 項（ 62 萬 ） ，其他 4 項（ 1183 萬）。 獲 省部級獎 三 項 。 本重點實驗室分工合作，擴建了于 2020 年 開始的 “ 985”三期項目所建的心血管轉基因中心 、形態(tài)學平臺 和 動物心血管功能分析平臺， 新建 了 代謝分析和代謝組學 兩 個平臺。 本重點實驗室 2020 年所取得的具體科研成果 總結如下： （一） 血管鈣化的作用機制研究 （ 1） 慢性炎癥促進高磷引起血管鈣 化的作用機制及其內源性保護新機制 2 本室研究 證實高磷本身可以升高線粒體膜電位，使線粒體超氧陰離子產生增加，后者通過激活 NFkB 從而介導了高磷引起的血管平滑肌鈣化的發(fā)生和發(fā)展（ Zhao et al, Kidney International, 2020）。 編輯部同期為我們文章 發(fā)表了述評， 對該文證明的 新機制 做了推介 。我們進一步在人鈣化動脈血管組織中發(fā)現(xiàn)，重要炎癥因子 TNFα可以明顯加重高磷引起的血管鈣化，這種作用與 TNFα激活 p65，進而促進內源性鈣化抑制因子 ANK 基因的降解 相關 。上述研究成果為臨床防治血管鈣化 提供了新的預防和治療靶點（ Zhao et al, Kidney International, Revised, 2020）。 （ 2） 發(fā)現(xiàn)血管鈣化新的抑制因子 COMP 血管鈣化與糖尿病、慢性腎病病人的心血管并發(fā)癥高發(fā)病率和死亡率密切相關。我們 分別在細胞鈣化模型、 5/6 腎切除及 CaCl2 局部損傷造成的血管鈣化動物模型 以 及透析病人的橈動脈 中 ， 發(fā)現(xiàn) 了 一種 血管基質糖蛋白 COMP 降解 增加 ， 導致了 血管平滑肌細胞向成骨 /成軟骨的重新轉分化 ， 在鈣磷的刺激下 ， 促進血管鈣化的發(fā)生 。因此， COMP 很可能 是一種內源性的血管鈣化抑制 因子 。進一步分析表明， COMP 抑制鈣化的 作用機制是通過與骨發(fā)生蛋白 BMP2相互結合 ,抑制其與受體結合 ，阻斷了 受體下 Smad1/5/8 信號傳導途徑，最終抑制血管鈣化發(fā)生 。該結果發(fā)表在心血管領域 一流雜志 的 Circ Res（ 2020） 。該文發(fā)表后， 被隨后的 兩期 Circ Res中 三篇關于血管鈣化的系列綜述 所 引用。進一步，我們發(fā)現(xiàn) COMP 水解酶 ADAMTS7 在血管鈣化早期即被誘導上調， ADAMTS7 介導了血管鈣化的發(fā)生。通過結合生物信息學技術和miRNA 芯片，我們發(fā)現(xiàn) miR29a/b 可通過調控 ADAMTS7 參 與血管鈣化的發(fā)生發(fā)展（ Circ Res 2020 修稿）。此外，我們 與臨床腎內科積極合作，發(fā)現(xiàn)血漿中 ADAMTS7 水平與慢性腎衰透析病人小血管鈣化程度正相關， 可能是 慢性腎衰病人心血管事件 的一個重要影響因素 （文章在總結中 ）。為了與國內鈣化研究領域的同行充分交流，我 們 組織了首屆“血管鈣化轉化醫(yī)學研究進展研討會“（ 2020， 日，北京） （ 3） 生物活性小分子在心血管疾病中的作用和機制研究 抗血管鈣化的內源性活性物質及其機制研究 包括以下三個方面 : ① Intermedin 在血管鈣 化中的作用和機制研究，發(fā)現(xiàn) Intermedin 抑制血管鈣化與其上調Klotho 基因有關 ； ② Intermedin 在心肌肥大中的作用和機制 ， 發(fā)現(xiàn) 了 Intermedin 可抑制腹主動脈縮窄所致的心肌肥大和心肌纖維化，其機制與其抑制內質網應激反應有關； 3 ③ 完善內質網應激通過上調激活的轉錄因子促進血管鈣化發(fā)生發(fā)展 ， 發(fā)現(xiàn) 了 給予 血管 鈣化大鼠 ?；撬?(TAU)或 4苯丁酸 (PBA)處理后， 鈣化組 內質網應激 標志物葡萄糖調節(jié)蛋白 78 (GRP78)、 GRP9剪切的 caspase12 蛋白表達顯著減少， 凋亡也明顯 降低，同時 VDN 大鼠 主動脈鈣含量分別降低 倍和 倍， ALP 活性分別降低 倍和 倍，血管壁鈣鹽沉積及VSMCs 成骨表型轉變均得到顯著性逆轉。 有意義的是，免疫組化結果 發(fā)現(xiàn) 鈣化人主動脈組織中 內質網應激 介導凋亡 的 關鍵性轉錄因子 ATF4 表達增加。 且在鈣化大鼠血管、離體 VSMCs鈣化早期和鈣化 晚期 ATF4 蛋白表達水平均明顯上調。敲低 VSMC 中 ATF4 后 再誘導鈣化 的結果表明 ATF4 介導 的內質網應激 凋亡 可能 參與血管鈣化的發(fā)生 。 該成果還 申報了 2020 年度高等學?？?學研究優(yōu)秀成果 二等獎 （目前在公示） 。 （二）花生四烯酸代謝產物研究 （ 1） 花生四烯酸代謝產物 8,9EET抑制 B細胞抗體產生及機制 EETs 四種異構體中， 8,9EET明顯抑制基礎狀態(tài)和經典有絲分裂原引起的脾臟 B細胞抗體分泌，其中對內毒素刺激引起的 IgM 分泌的抑制作用最為顯著，呈現(xiàn)時間和濃度依賴性。而5,6EET； 11,12EET， 14,15EET均沒有類似作用。進一步研究發(fā)現(xiàn) 8,9EET 明顯抑制 B細胞的增殖和減少存活 B 細胞的數(shù)目，促進 B細胞的凋亡、抑制 B 細胞的漿細胞化以及類別轉換。此外， 動脈粥樣硬化 獨立的危險因子之一 — 高同型半胱氨酸血癥 也 能夠增強小鼠脾臟 B淋巴細胞的炎癥反應性之一抗體分泌。我們的細胞實驗結果證明 外源給予 8,9EET也能夠顯著抑制同型半胱氨酸引起的小鼠脾臟 B 淋巴細胞的增殖和抗體分泌的增加。 進一步在體實驗結果表明，皮下埋泵緩釋給予小鼠 8,9EET（ 15 ng/hr, 6 天）明顯抑制不同免疫抗原誘導的生發(fā)中心形成，提示 8,9EET在體抑制體液免疫的機制之一可能是抑制了 B細胞在生發(fā)中心的成熟 (Gao et al. Plos One, 2020， 修稿中 ). （ 2） 花生四烯酸 （ AA） 代謝組學 研究進展 在運用動脈粥樣硬化模式小鼠研究代謝組學、 AA 代謝組變化與疾病變化規(guī)律方面，我們與中國科學院武漢物理與數(shù)學研究所 唐惠儒課題組展開 密切合作，已經開始研究 LDL受體基因敲除小鼠在不同飲食喂養(yǎng)下及 sEH 抑制劑干預下，花生四烯酸代謝譜的改變及整體代謝組變化譜。 已收集多種動物和細胞樣品（血液、組織培養(yǎng)上清液），已用 NMR 方法檢測部分尿樣及組織樣本，初步結果顯示不同動物組代謝譜明顯差異。進一步計劃通過將蛋白質組學與代謝組學方法與常規(guī)生物學方法相結合，尋找真正的 AA代謝在疾病狀態(tài)下的調控機制。 值得一提的是，在北京 大學醫(yī)學部的大力支持下，我們 已購置了用于檢測 AA代謝組學的 UPLCMSMS整套儀器 4 （ 350 萬元），建立了高通量 AA 代謝組檢測平臺。儀器已安裝調試完畢，并已進行 各種標準樣的檢測。即將計劃進行高通量 AA產物的測定。 （ 3） 可溶性表氧化物水解酶對心肌纖維化的作用及其機制研究 AngⅡ可以通過多種途徑導致心肌纖維化的發(fā)生，但其作用機制尚未完全闡明。花生四烯酸代謝產物 EETs 被認為是一種內源性心血管保護因子，而 sEH 可降解 EETs。本實驗室前期工作證實， AngⅡ可以上調大鼠心肌組織中 sEH 的表達；而在 AngⅡ誘 導的大鼠心肌肥厚動物模型中，應用 sEH 抑制劑可以預防心肌肥厚和心肌纖維化的發(fā)生。 為了進一步研究 sEH 與心肌纖維化的關系，我們用針對花生四烯酸代謝相關的酶、受體、作用靶點專門設計的基因芯片，檢測發(fā)現(xiàn) sEH 敲除在心臟中 CYP 通路的普遍抑制和 COX、 LOX通路酶和受體的普遍表達增高。提示 AA 一條通路被阻斷，可能反饋性引起其他通路產物的增高，為解釋 AA 代謝的網絡調節(jié)提供了有力證據。該結果正在整理投稿中。 MicroRNA 作為一種重要的轉錄后調節(jié)機制，參與了左室重塑的發(fā)生，但其作用機制至今仍沒有被完全闡明， 而 AA 代謝途徑對其影響也鮮有報道。我們采用了高通量的技術手段 ——MicroRNA 芯片檢測在 AngII 作用下 microRNA 的表達變化。結果表明， AngⅡ上調大鼠心肌組織中 mir21 的表達，而 sEH抑制劑可以抑制 AngⅡ對 mir21的上調作用。為驗證芯片結果并探討其中機理，我們構建了兩種心肌肥厚的動物模型小鼠。在 AngⅡ和 ISO誘導的小鼠心肌肥厚模型中，心肌組織中 mir21 的表達均增加；但應用 sEH 抑制劑對于 AngⅡ誘導的 mir21的表達沒有明顯影響；而在給予 ISO 處理后， sEHKO 小鼠心肌組織中的 mir21的表達水平較對照小鼠明顯增加。進一步的機制研究正在進行中 。 在高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠， sEH 抑制劑可以降低高脂飲食所誘導的脂肪肝和肝臟甘油三酯水平增高。而腺病毒過表達 sEH，可以使血漿及肝臟甘油三酯水平升高，肝臟脂質合成與攝取相關的基因表達增高，同時炎癥反應加強。因此我們認為抑制 sEH活性對炎癥及肝臟脂肪變所起到保護作用，進 一步的研究正在進行中 。 （ 4） 不同流體剪切力對血管內皮細胞損傷與保護的機制研究 已知層流對內皮具有保護作用，而湍流引起內皮功能異常。但是局部血流動力學改變在動脈粥樣硬化形成中的作用機制 尚未完全闡明。我們發(fā)現(xiàn)層流增加內皮細胞中花生四烯酸代謝產物 EETs。 EETs 通過激活 PPAR，增加 LXR 及其配體，進而上調與膽固醇外流相關蛋白，包括 ABCA1和 ABCG1的表達， 其中 ABCG1 在血管內皮細胞中表達高于 ABCA1， 維持內皮及血管壁的膽固醇 5 穩(wěn)態(tài)。而湍流增加細胞膜膽固醇含量，引起 ATP合成酶 β 亞基（ ATPSβ ）向細胞膜表面 caveolae轉位。其介導了 T細胞在內皮細胞上的粘附增加和激活。我們 在 本項目 中 提出了科學假說 ： 在高脂血癥的基礎上，湍流加重內皮細胞內膽固醇蓄積，促進 ATPSβ 到細胞膜 caveolae，進而增加 T 細胞在內皮上粘附 及 內皮的激活；而層流則通過改變 AA 代謝，增加 EETs，上調 ABCG1。ABCG1 通過增加細胞內膽固醇外排到 ApoAI/HDL， 改善高脂血癥引起的細胞內膽固醇蓄積；同時，減少 ApoAI 作為介質的 ATPSβ 與 T細胞的結合，抑制內皮細胞炎性損傷。 （ 5） 羥化酶及其產物 20HEHE 對細胞功能的影響 我們與美國加州大學 Hammock 教授 合作， 在 花生四烯酸代謝譜的改變方面取得了突破性進展。我們發(fā)現(xiàn)抑制 COX2 代謝通路在小鼠血液中增加 CYP通路中 20HETE 高達 120 倍，同時小鼠出 血時間明顯縮短。血小板聚集增加，為解釋 COX2 抑制劑加重心血管事