【正文】 《生物技術(shù)大實(shí)驗(yàn)》實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書生物技術(shù)教學(xué)部 常平安 舒坤賢 謝永芳 編重慶郵電學(xué)院生物信息學(xué)院2005年3月1日前 言《生物技術(shù)大實(shí)驗(yàn)》是為生物技術(shù)專業(yè)本科高年級學(xué)生開設(shè)的綜合實(shí)驗(yàn)課程，是在普通生物學(xué)實(shí)驗(yàn)、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)、微生物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞生物學(xué)和遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上的綜合實(shí)驗(yàn)課程。該實(shí)驗(yàn)課程偏重于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)，通過此實(shí)驗(yàn)課程，學(xué)生不僅學(xué)習(xí)到最基本的分子生物學(xué)技術(shù)，而且學(xué)習(xí)到前沿的生物技術(shù)。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)突飛猛進(jìn)，日新月異。分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，在20世紀(jì)下半葉對生命科學(xué)的進(jìn)步產(chǎn)生了舉世公認(rèn)的巨大推動作用，而且對人們的生活和整個社會的發(fā)展亦產(chǎn)生了巨大的沖擊和影響。分子生物學(xué)技術(shù)已廣泛滲透和應(yīng)用到生物學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)、微生物學(xué)、進(jìn)化學(xué)、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)、發(fā)育學(xué)、病毒學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、生藥學(xué)、法醫(yī)學(xué)等與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)有關(guān)的研究領(lǐng)域。21世紀(jì)將更是分子生物學(xué)技術(shù)快速發(fā)展的時期，由此引起的生物技術(shù)革命并將更加深刻地影響社會的發(fā)展。學(xué)生基本技能和動手能力的培養(yǎng)都離不開實(shí)驗(yàn)室，離不開實(shí)驗(yàn)課上的訓(xùn)練，很多理論上的原理都需要到實(shí)驗(yàn)課上去驗(yàn)證，很多理論上的知識都需要到實(shí)驗(yàn)課上去實(shí)踐。而實(shí)驗(yàn)課教材或?qū)嶒?yàn)指導(dǎo)書是開好實(shí)驗(yàn)課的基本條件之一。 雖然目前的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教材版本眾多，但針對本科生的生物技術(shù)大實(shí)驗(yàn)教材尚無出版。為了加強(qiáng)本學(xué)科的教材建設(shè)，促進(jìn)本學(xué)科實(shí)驗(yàn)課的開設(shè)，我們參考了國內(nèi)外最新的有關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的專著，根據(jù)我校學(xué)生的特點(diǎn)及我們自己現(xiàn)有的基礎(chǔ)和條件，特選擇了部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，并結(jié)合我們的經(jīng)驗(yàn)與體會，匯編成了生物技術(shù)大實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書，以供參考。在使用過程中，可根據(jù)不同的層次適當(dāng)增減。同時，對于新近產(chǎn)生和應(yīng)用前景廣闊的生物芯片技術(shù)、RNAi技術(shù)和蛋白質(zhì)組研究等，限于我們目前的條件，只能作些演示或作為動態(tài)給以介紹，條件一經(jīng)成熟，即行開設(shè)。由于分子生物學(xué)技術(shù)和生物技術(shù)的快速發(fā)展，加之我們是第一次這樣系統(tǒng)地給學(xué)生開設(shè)生物技術(shù)大試驗(yàn)課程，許多工作還處于不斷探索的過程中，難免有不妥和疏漏之處，懇切期望讀者提出寶貴意見，以利不斷修正完善。 編 者2005年3月目 錄實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒的提取和純化 ……………………………………………. 3實(shí)驗(yàn)二 質(zhì)粒DNA的電泳和純度檢測…………….……………………..6實(shí)驗(yàn)三 PCR產(chǎn)物的TA克隆……………………………………………...9實(shí)驗(yàn)四 感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備…………………………………...12實(shí)驗(yàn)五 重組DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌…………………………………........12實(shí)驗(yàn)六 PCR擴(kuò)增基因特異片段………………………………………..15實(shí)驗(yàn)七 DNA片段的回收及純化………………………………………..19實(shí)驗(yàn)八 PCR法快速鑒定重組載體……………………………………...22實(shí)驗(yàn)九 限制性內(nèi)切酶酶切法鑒定重組質(zhì)?！?..24實(shí)驗(yàn)十 外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)及其檢測……………………….28實(shí)驗(yàn)十一 RNA的提取及其純度檢測……………………………………32實(shí)驗(yàn)十二 逆轉(zhuǎn)錄PCR（RTPCR）擴(kuò)增基因特異片段…………………..35實(shí)驗(yàn)十三 DNA探針制備……………………………………………..…38實(shí)驗(yàn)十四 Southern印跡雜交……………………………………………41實(shí)驗(yàn)十五 Northern印跡雜交……………………………………………44實(shí)驗(yàn)十六 熒光原位雜交（FISH）技術(shù)…………………………………47實(shí)驗(yàn)十七 外源基因在哺乳細(xì)胞中的表達(dá)及其檢測…………………...50實(shí)驗(yàn)十八 生物芯片技術(shù)………………………………………………...53實(shí)驗(yàn)十九 RNAi技術(shù)……………………………………………………56實(shí)驗(yàn)二十 蛋白質(zhì)組技術(shù)………………………………………………...58附錄 基因工程基本技術(shù)路線…………………………………………….60實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒的提取和純化實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私鈮A裂解法制備質(zhì)粒的原理，掌握質(zhì)粒的小量制備方法。實(shí)驗(yàn)原理：質(zhì)粒DNA的抽提是基因工程操作中最常用與最基本的技術(shù)，現(xiàn)已有多種成熟的方案可供選擇。最常用的有利用堿性條件下質(zhì)粒DNA與染色體DNA變復(fù)性的不同進(jìn)行分離的堿法；利用酸性、低離子強(qiáng)度時超螺旋在水相中，開環(huán)、線型分子在酚相中進(jìn)行分離的酸酚法；利用羥基磷灰石在特定的條件下(8mol／L尿素，／L磷酸緩沖液pH＝)只吸附雙鏈DNA的羥基磷灰石法(在上述條件下染色體DNA均成單鏈，質(zhì)粒DNA保持雙鏈)等。本實(shí)驗(yàn)選做的是堿法。1. 裂解細(xì)胞 裂解細(xì)胞是指通過溶菌酶、去污劑等試劑破裂細(xì)胞壁與膜的過程。對于不同的菌要選用不同的方法，通常有煮沸法、非離子型去污劑法、堿性SDS法(簡稱堿法)等。三種方法比較而言，非離子型去污劑法較溫和，適用于抽提10kb左右的質(zhì)粒；而煮沸法與堿性SDS法相對較劇烈，只能抽提小于10kb的質(zhì)粒。常用的離子型去污劑是SDS、非離子型去污劑有Triton X100等。2．分離 即將質(zhì)粒DNA和染色體DNA分離。堿法的分離原理如下：大腸桿菌的染色體約有4700kb長，在處理細(xì)胞過程中都斷裂成不同長度的雙鏈DNA片段。當(dāng)溶液的pH調(diào)到大于12時雙鏈DNA中的氫鍵被破壞，于是染色體DNA的雙鏈分離成單鏈；而超螺旋狀態(tài)的質(zhì)粒DNA僅僅是氫鍵被破壞，并只發(fā)生部分雙鏈解離成單鏈的變化。再當(dāng)pH調(diào)回中性時單鏈DNA互相纏繞且與蛋白質(zhì)結(jié)合生成網(wǎng)絡(luò)狀大分子，而超螺旋的質(zhì)粒發(fā)生復(fù)性反應(yīng)后仍是小分子，通過離心的方法很容易將二者分開，達(dá)到分離的目的。3．純化 細(xì)胞裂解液中的雜質(zhì)除了染色體DNA外還有各種細(xì)胞壁、膜碎片、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)類物質(zhì)及RNA。純化的步驟就是有針對性地將它們?nèi)コ?。RNA可用牛胰Rnase A分解除去。蛋白質(zhì)可通過酚、酚／氯仿、氯仿／異戊醇，使蛋白質(zhì)變性劑而除去，同時，氯仿有強(qiáng)烈的溶脂傾向，對于在除去蛋白質(zhì)的同時去除脂質(zhì)類雜質(zhì)很有好處。氯仿還能將微量的、溶于DNA水溶液的酚抽提掉，而微量的酚對于以后的酶切、轉(zhuǎn)化等過程都會產(chǎn)生不利影響。氯仿／異戊醇的蛋白質(zhì)變性能力較弱，主要用于含酚試劑處理后的抽提。正確的去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)的過程應(yīng)該是酚一酚+氯仿（(1:1)）一氯仿（或氯仿／異戊醇24:1)，處理，根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況也可考慮省略第一或第二步，但切記不可將氯仿（氯仿／異戊醇）的處理步驟省略掉。抽提過程完成后的水溶液中仍有痕量的酚、氯仿等，可用乙醇沉淀的方法將它們除去。用無水乙醇沉淀的特點(diǎn)是能將DNA進(jìn)行濃縮，且同時也更換了整個緩沖系統(tǒng)，但DNA也有一定的損失。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：試劑(1L)細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨 10g細(xì)菌培養(yǎng)用酵母粉 5gNaCl 10g用10mol／L ，高壓蒸氣滅菌, 4℃貯存.2．溶液Ⅰ，可成批配置，滅菌后4℃貯存。葡萄糖50mmol／LTrisC1()25mmol／LEDTA10mmol／L3．溶液Ⅱ(新鮮配制)NaOH ／L SDS 1％4．溶液Ⅲ5mol／L KAc60ml冰醋酸水配制好的溶液Ⅲ含3mol／L鉀鹽，5mol／L 醋酸()卡那霉素(Kana): 50mg/ml, 過濾除菌.5．重蒸酚 市售苯酚蒸餾純化(收集179～181℃之間的酚)后，用TE飽和，4℃保存。6．氯仿 異戊醇(24:1)7．無水乙醇8．RNaseA(10mg／ml)9．3mol／L NaAc()10．TE 10mmol／L TrisC1() 1mmoI／L EDTA材料 含有質(zhì)粒(pNTEEGFP, pEGFPN3)的大腸桿菌DH5a.操作步驟 1．挑取瓊脂培養(yǎng)板上的含有pNTEEGFP, pEGFPN3質(zhì)粒的單菌落，接種至5ml LB培養(yǎng)液(含Kana 50μg／m1)，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。 2．，12 000r／min離心2min，棄上清。 3．將細(xì)菌沉淀重懸于100μl預(yù)冷的溶液工中，強(qiáng)烈振蕩混勻。 4．加入200μl溶液Ⅱ，蓋嚴(yán)管蓋，輕輕顛倒混勻5次，冰浴5min。 5．加入150μl預(yù)冷的溶液Ⅲ，溫和振蕩10s，冰浴5min。 6．12 000r／min 室溫離心5min， Eppendorf管中。 7．加入等體積酚／氯仿(1:1)，振蕩混勻，12 000r／min離心2min，上清轉(zhuǎn)移至另一個Eppendorf管中。【注意】酚具有腐蝕性，操作時小心。 8．加人等體積氯仿，振蕩混勻，12 000r／min離心2min，上清轉(zhuǎn)移至另一個Eppendorf管中。 10．加入2倍體積預(yù)冷無水乙醇20℃沉淀10min。 11．12 000r／min離心10min，去上清，沉淀用70％乙醇洗滌一次，空氣中晾干。 12．加入20μl TE溶解質(zhì)粒DNA，加入RNaseA，終濃度20μg／m1 37℃。13 ％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后觀察抽提結(jié)果?！咀⒁狻縀B為致癌物，操作時一定要戴乳膠或一次性手套。 14．將該管質(zhì)粒保存于20℃?zhèn)溆?。注意事?xiàng) 1．該實(shí)驗(yàn)成功的標(biāo)志是把染色體DNA、蛋白質(zhì)與RNA去除干凈，獲得一定得率的質(zhì)粒DNA。去掉染色體DNA最為重要，也較困難，因?yàn)樵谌刻崛∵^程中，只有一次機(jī)會去除染色體DNA，其關(guān)鍵步驟是加入溶液Ⅱ與溶液Ⅲ時，控制變性與復(fù)性操作時機(jī)，既要使試劑與染色體DNA充分作用使之變性，又要使染色體DNA不斷裂解成小片段，從而能與質(zhì)粒DNA相分離。這就要求試劑與溶菌液充分搖勻，搖動時用力適當(dāng)，一般來說當(dāng)溶液Ⅰ加入時可用力振蕩幾次，因?yàn)榇藭r細(xì)菌還沒有與堿和SDS作用，染色體DNA尚未釋放，不必?fù)?dān)心其分子斷裂，加入SDS后，則要注意不能過分用力振蕩，溫和混勻,但又必須讓它反應(yīng)充分。加入溶液II混勻之后,一定在冰上放置,不要搖動,對于溶液溶液III,同樣處理! 2. 加入溶液I之前,注意將離心管倒扣過來,將培養(yǎng)基完全流出. 2．加乙醇沉淀DNA時，要把離心管加蓋倒翻搖動4～5次，注意觀察水相與乙醇之間沒有分層現(xiàn)象之后，才可以放在冰箱中去沉淀DNA,以獲得更多的DNA。 3．乙醇沉淀DNA離心后，要把離心管四周的上清液抽干或自然揮發(fā)(可將離心管倒置于濾紙上以盡量讓管內(nèi)液體流出)。否則，用TE緩沖液溶解DNA時，既困難又不完全。 4．為了得到純凈的DNA樣品和清晰的電泳條帶，加入1μl RNA酶，將管置50℃水浴箱內(nèi)30min，消化RNA。 6．抽提產(chǎn)物經(jīng)電泳分離、EB染色后，在紫外線燈下可觀察到三個條帶，自前往后分別為：超螺旋、線性及開環(huán)質(zhì)粒DNA。【思考題】堿法提取質(zhì)粒的原理是什么？【課外閱讀】高純度質(zhì)粒DNA的提取,參閱Qiagen公司說明書,網(wǎng)站:實(shí)驗(yàn)二 質(zhì)粒DNA的電泳和純度檢測實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆誅NA瓊脂糖電泳技術(shù)，了解紫外分光光度法測定DNA濃度和純度的原理。實(shí)驗(yàn)原理：帶電荷的物質(zhì)在電場中的趨向運(yùn)動稱為電泳。其中，凝膠電泳由于其操作簡單、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，使它成為分離、鑒定和提純核酸的首選標(biāo)準(zhǔn)方法。 與蛋白質(zhì)分子類似，核酸分子也是兩性解離分子。，堿基上的氨基基團(tuán)解離，而三個磷酸基團(tuán)中只有第一個磷酸解離，整個分子帶正電荷，在電場中向負(fù)極泳動；～，堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負(fù)電荷，向正極移動。不同大小和構(gòu)象的核酸分子的電荷密度大致相同，在自由泳動時，各核酸分子的遷移率區(qū)別很小，難以分開。所以采用適應(yīng)濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，發(fā)揮分子篩的功能，使得分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子泳動率出現(xiàn)較大差異，達(dá)到分離的目的。值得注意的是，等長度的單鏈DNA和雙鏈DNA在中性或堿性凝膠中的遷移率大致相等。 1．影響泳動的四大因素 (1)影響泳動的首要因素是電泳樣品的物理性質(zhì)：包括電荷多少、分子大小、顆粒形狀和空間結(jié)構(gòu)。一般來說顆粒帶電荷的密度愈大，泳動速率愈快；顆粒物理形狀愈大，與支持物介質(zhì)摩擦力越大，泳動速度越小。即泳動率與顆粒的分子大小，介質(zhì)粘度成反比；與顆粒所帶電荷成正比。在檢測未知DNA分子量時，DNA分子的空間構(gòu)型不同，即使相同的分子量其遷移率也不同。如質(zhì)粒DNA存在閉環(huán)(Ⅰ型，CC)，單鏈開環(huán)(Ⅱ型，OC)和線性(Ⅲ型，L)。三者之間的遷移速率，一般為Ⅰ型Ⅲ型Ⅱ型，但是有時也會出現(xiàn)相反的情況，因?yàn)榕c瓊脂糖濃度、電流強(qiáng)度、離子強(qiáng)度及溴乙錠染料含量有關(guān)。當(dāng)膠濃度較高或電場強(qiáng)度較大時，Ⅰ型DNA與Ⅲ型DNA互換位置，而Ⅱ型DNA總是遷移最慢。 (2)支持物介質(zhì)：DNA的凝膠電泳常使用兩種支持材料：瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠。通過這兩種介質(zhì)的濃度變化調(diào)整所形成凝膠的分子篩網(wǎng)孔大小，分離不同分子量的核酸片段。瓊脂糖凝膠的孔徑大，可以分離長度為100bp至近60kb的DNA分子；聚丙烯酰胺凝膠的孔徑小，可分離小片段(5～500bp)DNA，效果最好。因此，選用不同的凝膠種類和濃度可以分辨大小不同的DNA片段。(3)電場強(qiáng)度：電泳場兩極間單位支持物長度的電壓降即為電場強(qiáng)度或電壓梯度。電場強(qiáng)度愈大，帶電顆粒的泳動速率愈快，但凝膠的有效分離范圍隨電壓的增大而減小。在低電壓時，線性DNA分子的泳動率與電壓成正比。一般凝膠電泳的電場強(qiáng)度不超過5V／cm；～／cm電泳過夜，以取得較好的分辨率和整齊的帶型。電壓1000～2000V，電場強(qiáng)度20～600V／cm的電泳為高壓電泳，必須用聚丙烯酰胺做介質(zhì)。(4)緩沖液離子強(qiáng)度：緩沖液是電泳場中的導(dǎo)體，它的種類、pH值、離子濃度直接影響電泳的效率。，由于Cl—的泳動速度比樣品分子快得多，易引起帶型不均一現(xiàn)象，所以常利用TAE、TBE和TPE三種緩沖體系。緩沖液的pH值直接影響DNA解離程度和電荷密度，緩沖液pH值與DNA樣品的等電點(diǎn)相距越遠(yuǎn)，樣品所攜帶電荷量越多，泳動速度越