【正文】 基因工程原理復(fù)習(xí)題思考題基因工程緒論基因工程的定義與特征。定義：在體外把核酸分子（DNA的分離、合成）插入載體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合（重組DNA），引入原先沒(méi)有這類(lèi)分子的受體細(xì)胞內(nèi)，穩(wěn)定地復(fù)制表達(dá)繁殖，培育符合人們需要的新品種（品系），生產(chǎn)人類(lèi)急需的藥品、食品、工業(yè)品等。特征：具跨越天然物種屏障的能力。 強(qiáng)調(diào)了確定的DNA片段在新寄主細(xì)胞中的擴(kuò)增。試述基因工程的主要研究?jī)?nèi)容。1）、目的基因的分離2）、DNA的體外重組（載體、受體系統(tǒng)等）3）、重組DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞及其篩選4）、基因在受體細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增、表達(dá)、檢測(cè)及其分析?；蚬こ淘谑称饭I(yè)上有何應(yīng)用發(fā)展？主要是通過(guò)基因重組，使各種轉(zhuǎn)基因生物提高生產(chǎn)谷氨酸、調(diào)味劑、酒類(lèi)和油類(lèi)等有機(jī)物的產(chǎn)率；或者改良這些有機(jī)物組成成分，提高利用價(jià)值。轉(zhuǎn)基因是一把雙刃劍，請(qǐng)客觀談?wù)剬?duì)轉(zhuǎn)基因及轉(zhuǎn)基因食品安全性的認(rèn)識(shí)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)所帶來(lái)的好處是顯而易見(jiàn)的，在人類(lèi)歷史進(jìn)步和發(fā)展中起到了積極作用。首先，通過(guò)該項(xiàng)技術(shù)可以提供人們所需要的特性，改良培育新品種；第二，延長(zhǎng)食品保存時(shí)間或增加營(yíng)養(yǎng)成分；第三，將抗蟲(chóng)防菌基因轉(zhuǎn)入到作物中，使作物本身產(chǎn)生抵抗病蟲(chóng)害侵襲的能力， 減少了農(nóng)藥的使用量，有利于環(huán)境保護(hù)；第四，轉(zhuǎn)基因技術(shù)及基因食物在醫(yī)學(xué)方面得到廣泛研究和應(yīng)用。人們對(duì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的主要擔(dān)憂在于環(huán)境方面。外源基因的導(dǎo)入可能會(huì)造就某種強(qiáng)勢(shì)生物， 產(chǎn)生新物種或超級(jí)雜草、損害非目標(biāo)生物、破壞原有生物種群的動(dòng)態(tài)平衡和生物多樣性，也即轉(zhuǎn)基因生物存在潛在的環(huán)境安全問(wèn)題。轉(zhuǎn)基因作物的大面積種植已有數(shù)年， 食用轉(zhuǎn)基因食品的人群至少有10億之多，但至今仍未有轉(zhuǎn)基因食品對(duì)生命造成危害的實(shí)例；更何況目前每一種基因工程食品在上市前，都要經(jīng)過(guò)國(guó)家法律認(rèn)可， 食品衛(wèi)生部門(mén)和環(huán)境部門(mén)的嚴(yán)格檢測(cè)。只有測(cè)試合格了，才能投放市場(chǎng)。因此公眾完全可以安全地消費(fèi)、大膽地食用轉(zhuǎn)基因食品。第一章 DNA的分子特性與利用 原核生物和真核生物的基因表達(dá)調(diào)控有何差別？1）原核基因表達(dá)調(diào)控的三個(gè)水平：轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、翻譯水平調(diào)控、蛋白質(zhì)加工水平的調(diào)控原核基因表達(dá)調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控。2）真核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)：l 1．基因組DNA存在的形式與原核生物不同；l 2．真核生物中轉(zhuǎn)錄和翻譯分開(kāi)進(jìn)行；l 3．基因表達(dá)具有細(xì)胞特異性或組織特異性；l 4．真核基因表達(dá)的調(diào)控在多個(gè)水平上進(jìn)行：DNA水平的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控、翻譯水平調(diào)控、蛋白質(zhì)加工水平的調(diào)控； 什么是基因？根據(jù)基因的產(chǎn)物，基因可分為哪三類(lèi)？基因是具有生物學(xué)功能的、在染色體上占據(jù)一定位置的一段核苷酸序列，是分子遺傳的功能單位。根據(jù)基因的產(chǎn)物，基因可分為三類(lèi)：l 轉(zhuǎn)錄并翻譯編碼蛋白質(zhì)的基因: 包括結(jié)構(gòu)蛋白基因、編碼酶的基因、調(diào)節(jié)基因l 轉(zhuǎn)錄但不翻譯產(chǎn)物的基因: 包括tRNA、rRNAl 不轉(zhuǎn)錄但有功能的DNA區(qū)段: 如啟動(dòng)子、操縱基因 引起核酸變性的因素主要有哪些？核酸變性后性質(zhì)有何變化？引起核酸變性的因素：溫度、酸、堿、甲醛和尿素等。DNA變性后，它的一系列性質(zhì)發(fā)生變化，如紫外吸收(260 nm)值升高（增色效應(yīng)）, 粘度降低等，如DNA增加25－40%. %。 DNA復(fù)性及其影響因素。變性DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開(kāi)的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過(guò)程稱為復(fù)性。DNA復(fù)性的程度、速率與復(fù)性過(guò)程的條件有關(guān)，也與它本身的組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)：分子量越大復(fù)性越難。濃度越大，復(fù)性越容易。（附加：注意：將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時(shí)，DNA不可能復(fù)性。但是將變性的DNA緩慢冷卻時(shí)，可以復(fù)性。復(fù)性的應(yīng)用：核酸的雜交，分子擴(kuò)增）第二章 基因工程操作的基本技術(shù)1. DNA凝膠電泳中核酸分子分離的機(jī)理。 在堿性環(huán)境下，核酸分子帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)的作用下，分子在凝膠多孔性剛性濾孔中從負(fù)極向正極泳動(dòng)，其中主要由于分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)達(dá)到分離不同大小核酸分子的目的。2. DNA凝膠電泳中影響電泳遷移率的因素主要有哪些？1）分子本身的影響 216。分子的大?。盒t快 216。帶電荷數(shù)：多則快 216。分子構(gòu)型：超螺旋解螺旋2）電場(chǎng)：直流電場(chǎng) 216。電壓高則快 216。電壓太高則結(jié)果不準(zhǔn)確常用3~5V/CM3）支持物介質(zhì) 216。種類(lèi)：瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠 216。凝膠濃度: 濃度大，篩孔小，適合小分子電泳；濃度小，篩孔大，適合大分子電泳4）電泳緩沖液 220。 pH值：偏堿性，帶負(fù)電荷 220。 離子濃度：離子濃度高_(dá) 電流大_發(fā)熱快_膠溶解 220。種類(lèi)：TAE、TBE、TPE、TNE3. PCR的原理和主要反應(yīng)過(guò)程，并分析影響PCR擴(kuò)增的影響因素。PCR原理：變性溫度下， DNA雙鏈變性雙螺旋解開(kāi)成單鏈DNA，在退火溫度中人工合成的特異引物根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與單鏈DNA特異結(jié)合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸溫度下不同的脫氧核苷酸按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則在引物的引導(dǎo)下合成與模板DNA互補(bǔ)的新鏈，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增。影響PCR擴(kuò)增的影響因素：167。(1)Taq酶：常用1U/25181。L 179。濃度低，擴(kuò)增產(chǎn)物不夠； 179。濃度高，非特異性擴(kuò)增增加； 179。酶的活性；167。(2)dNTP的濃度：常用100200181。mol/L，不能低于20181。mol/L，特異性、保真性；167。(3)模板：主要考慮純度及使用量，對(duì)純度要求不高，但含有酚、氯仿等雜質(zhì)則難以成功。使用量從幾個(gè)ng到100ng.167。(4)引物濃度：，過(guò)多則非特異擴(kuò)增增加，形成引物二聚體；167。(5)Mg2+濃度：常用 ； 影響：酶的活性、引物模板退火、特異性167。(6)PCR反應(yīng)程序設(shè)定：變性溫度和時(shí)間、引物退火溫度Tm與時(shí)間、引物延伸溫度與時(shí)間和循環(huán)數(shù)4. PCR引物設(shè)計(jì)的原則，若給一指定DNA序列并需要通過(guò)PCR擴(kuò)增此序列，如何設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物？（關(guān)于如何設(shè)計(jì)這個(gè)問(wèn)題，靠自己了）引物設(shè)計(jì)原則： G+C含量4555%； Tm值高于55； 引物特異性； 引物擴(kuò)增跨度； 是否形成引物二聚體5. 定量PCR的原理？Ct值的含義。原理：通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板進(jìn)行定量及定性的分析。初始模板量X0的對(duì)數(shù)值與C(T) 值之間呈線性關(guān)系：log X0= log(1+Ex) *Ct+ log N Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)開(kāi)始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段時(shí)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（如后圖所示，圖僅供參考）Threshold line C(t) value C(t) value +/閾值線Ct值Ct值6. 分子雜交的類(lèi)型主要有哪些？探針的標(biāo)記方法與標(biāo)記類(lèi)型？常用的雙鏈DNA的標(biāo)記方法是哪兩種？探針的標(biāo)記方法：切口平移法、隨機(jī)引物合成法，末端標(biāo)記法，PCR標(biāo)記法，體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記法。探針按核酸分子分：DNA探針和RNA探針；按標(biāo)記物的不同：放射性標(biāo)記探針和非放射性標(biāo)記探針。標(biāo)記類(lèi)型：按核酸分子的不同：可分為DNA探針和RNA探針根據(jù)標(biāo)記物的不同：可分放射性標(biāo)記探針和非放射性標(biāo)記探針；雙鏈DNA探針標(biāo)記主要方法：切口平移法、隨機(jī)引物合成法；7. Southern雜交一般過(guò)程及影響雜交因素。Southern雜交操作步驟:(1) 用限制性內(nèi)切酶酶切DNA, 經(jīng)凝膠電泳分離各酶切片段； (2) 轉(zhuǎn)膜：將DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上；(3) 預(yù)雜交：封阻濾膜上非特異性位點(diǎn)； (4) 雜交：讓探針與同源DNA片段特異性結(jié)合；(5) 洗脫：去除非特異性結(jié)合的探針；(6) 自顯影檢查目的DNA所在的位置。Southern雜交影響因子1）、目的DNA在總DNA中所占的比例2）、探針的大小和標(biāo)記效率3）、轉(zhuǎn)移到濾膜上的DNA量4）、探針與靶DNA的同源性8. 基因組文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程？如何確定文庫(kù)的大小？基因組文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程：1）從生物體提取大片斷的基因組DNA；2）用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶（常為4堿基識(shí)別位點(diǎn)）進(jìn)行部分酶切或超聲波打斷基因組DNA ；3）在瓊脂凝膠電泳上或蔗糖梯度離心篩選適當(dāng)長(zhǎng)度的DNA片斷（根據(jù)載體的要求）； 4）載體的酶切、回收；5）將處理好的基因組DNA片斷與載體連接；6）將重組子導(dǎo)入宿主細(xì)胞7）文庫(kù)的鑒定、收集、保存；確定文庫(kù)大小的方法：以在構(gòu)建的基因組文庫(kù)中任一基因存在的概率來(lái)衡量文庫(kù)的質(zhì)量或完備性，它與基因文庫(kù)最低所含克隆數(shù)N（即文庫(kù)大?。┲g的關(guān)系可用下式表示： N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f ) 其中： N：文庫(kù)所需的總克隆數(shù)； P：任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸?kù)中）的概率； f：克隆片段的平均大小/ 生物基因組的大小。9. 基因文庫(kù)的類(lèi)型包括哪兩種？各有什么特點(diǎn)？10. 一般質(zhì)粒DNA的構(gòu)型有哪幾種？在瓊脂糖凝膠電泳中的有何特點(diǎn)？超螺旋質(zhì)粒DNA、開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA、線狀質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠電泳的特點(diǎn)是：電泳的泳動(dòng)速度由大到小分別是：超螺旋質(zhì)粒DNA線狀質(zhì)粒DNA開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA11. 堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理，分析影響試驗(yàn)結(jié)果的各種可能因素。堿裂解法原理：在堿性條件下，雙連DNA氫鍵斷裂，結(jié)構(gòu)破壞變性，環(huán)狀超螺旋質(zhì)粒不充分變性。在中性條件下變性質(zhì)粒恢復(fù)原來(lái)構(gòu)型，而線性大分子細(xì)菌DNA不能復(fù)性呈不溶物而經(jīng)離心除去。（各種可能因素是上一屆的，具體其實(shí)大家可以根據(jù)那天師兄說(shuō)的去寫(xiě)）提取失敗：1）洗去雙鏈時(shí)，將質(zhì)粒DNA洗去； 2）破壁失敗，質(zhì)粒沒(méi)析出； 3）加劑問(wèn)題電泳失?。?）電壓太高 2）沒(méi)加染色劑 3）膠穿孔 4）電泳時(shí)間過(guò)長(zhǎng)12. 電泳緩沖液使用一定時(shí)間后出現(xiàn)DNA在凝膠中跑不動(dòng)現(xiàn)象的原因，有何解決辦法？原因：電泳緩沖液的離子的富集作用；解決方法：； 13. 電泳的指示劑和染色劑有何區(qū)別，各自的作用是什么？指示劑一定要在電泳前加入，指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液；（一般為：溴酚蘭，二甲苯青）作用：①預(yù)知電泳的速率及方向；②使樣品呈現(xiàn)顏色，便于加樣；③一些高濃度蔗糖或其它物質(zhì)增加DNA的密度，可以防止DNA的擴(kuò)散染色劑即可以在電泳前加入樣液，又可以電泳后再對(duì)凝膠染色；（溴化已錠[EB]、硝酸銀、Goldview染料）作用：呈現(xiàn)出核酸電泳后的帶型。第三章 基因克隆的酶學(xué)基礎(chǔ) 限制性核酸內(nèi)切酶的類(lèi)型，基因工程常用的是哪種限制性核酸內(nèi)切酶？（常用II型） 什么是星活性，產(chǎn)生星活性的因素可能有哪些？在非最適合的條件下酶的識(shí)別特異性降低，產(chǎn)生非特異性帶，這種活性稱星活性。產(chǎn)生Star活性的因素：（書(shū)上P46P47答案）高濃度甘油，堿性pH，存在Mn2+，低離子強(qiáng)度，低鹽濃度，低pH 結(jié)合已做的實(shí)驗(yàn)，分析影響酶切的因素。（這個(gè)答案是上屆的，僅供參考）1）DNA的純度：DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會(huì)影響酶的活性。 2）DNA的甲基化程度 ：dam甲基化酶（修飾GATC中的A）； dcm甲基化酶（修飾CCA/TGG的C）。3）溫度 ：不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37 oC，少數(shù)要求4065 oC。4）緩沖液(Buffer)：是影響限制酶活性的重要因素。 MgClNaCl/KCl：提供Mg2+和離子強(qiáng)度； TrisHCl：維持pH； 二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性； 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定；β－巰基乙醇：保持酶的穩(wěn)定性，防止酶失活 限制性核酸內(nèi)切酶命名規(guī)則及各字母代表的含義。（例子和圖幫助大家理解而已）命名規(guī)則：寄主菌屬名的第1個(gè)字母＋種名的前兩個(gè)字母＋菌株或菌型代號(hào)（大寫(xiě)）＋空白＋發(fā)現(xiàn)序列（羅馬數(shù)字）例子：EcoRⅠ(E：屬名；co：種名；R：株；Ⅰ：發(fā)現(xiàn)次序) 簡(jiǎn)單敘述同尾酶和同裂酶的差別。同尾酶：來(lái)源不同，識(shí)別的序列不同，但能切出相同的粘性末端，連接后不能被相關(guān)的酶同時(shí)切割。同裂酶：識(shí)別序列相同，切割位點(diǎn)有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同。 不完全同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同。） 連接酶主要有哪些類(lèi)型？有何異同點(diǎn)？影響連接酶連接效果的因素主要有哪些？類(lèi)型：DNA連接酶和RNA連接酶異同點(diǎn)：相同點(diǎn)：都能以DNA為模板，從539。向339。進(jìn)行核苷酸或脫氧核苷酸的聚合反應(yīng)。不同點(diǎn)：DNA聚合酶識(shí)別脫氧核糖核苷酸，在DNA復(fù)制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在轉(zhuǎn)錄中起作用。 影響因素：（影響因素就四個(gè)，后面分析覺(jué)得煩的話大家自己看著辦啦）1）連接所用的目的片段的狀態(tài)： 185。 效率：粘性末端平端(100倍)； 185。 5，突出3，突出； 185。平端：HaeIIIAluIHinCIISmaI2）連接溫度 185。連接效果最好在37 ℃，但形成的互補(bǔ)不穩(wěn)定。185。最佳連接溫度：1216