【正文】 第四章 酶的提取與分離純化 ?預(yù)處理 （ pretreatment） ：包括固液分離和細(xì)胞破碎（分離胞內(nèi)產(chǎn)物）等。 ?初步純化 （ rough fractionation） （提?。撼ヅc目的產(chǎn)物性質(zhì)差異很大的雜質(zhì)。 ?高度純化 （ fine fractionation） （精制）：除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)。 ?濃縮與干燥 （ concentration and desiccation）（成品加工） :使酶與溶劑分離的過程。 第一節(jié) 酶的分離 一、發(fā)酵液預(yù)處理 (一 )發(fā)酵液的相對純化 1. 無機(jī)離子的去除 2. 雜蛋白質(zhì)的去除 3. 色素及其他物質(zhì)的去除 (二）發(fā)酵液的固液分離 1 . 影響發(fā)酵液過濾的因素 ?1）菌種 ?2）培養(yǎng)基組成 2. 提高過濾性能的方法 1）絮凝和凝聚 2）稀釋、加熱 3）加助濾劑， 常用硅藻土等。 二、細(xì)胞破碎 （一） 細(xì)胞壁組成 ?細(xì)胞壁的主要成分： ? 細(xì)菌：肽聚糖 (N乙酰萄糖胺， N乙酰胞壁酸 ) ? 酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白質(zhì) ? 真菌 : 多糖（幾丁質(zhì)和葡聚糖） ? 微生物 革蘭氏陽性細(xì)菌 革蘭氏陰性細(xì)菌 放線菌 酵母菌 霉菌 壁厚/nm 15 ~ 50 10 ~ 13 同 G+ 100 ~ 300 100 ~ 250 層次 單層 多層 多層 多層 主要組成 肽聚糖 (40% ~ 90%) 多糖 胞壁酸 蛋白質(zhì) 脂多糖 (1%? 2%) 肽聚糖 (5% ~ 10%) 脂蛋白 脂多糖 (11% ~ 22%) 磷脂 蛋白質(zhì) 葡聚糖 (30% ~ 40%) 甘露聚糖 (30%) 幾丁質(zhì) (1% ~ 2%) 蛋白質(zhì) (6% ~ 8%) 脂類 (% ~ %) 多聚糖 (80% ~ 90%) 脂類 蛋白質(zhì) 各種微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與組成 細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu) 酵母菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu) M— 甘露聚糖； P— 磷酸二酯鍵； G— 葡聚糖 （二）細(xì)胞破碎的方法 ? 機(jī)械法 ? 物理法 ? 化學(xué)法 ? 生物法（酶解） ?： ? 1）液體剪切：攪拌、勻漿。 ? 2）固體剪切：研磨，珠磨，搗碎。 ? ： ? 1）超聲波破碎法。 ? 2）滲透壓突變法：高滲（蔗糖，高鹽等） ? 平衡后迅速轉(zhuǎn)入低滲溶液或水中。 ? 3）凍融法：反復(fù)低溫冰凍，室溫融化。 ?3. 化學(xué)法 應(yīng)用各種化學(xué)試劑與細(xì)胞膜作用，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變或破壞。 ? 1）有機(jī)溶劑處理： 破壞膜磷脂結(jié)構(gòu)，常用 ?丙酮、丁醇、氯仿等。 ? 2）表面活性劑處理： 常用非離子型表面 ?活性劑，如 Triton X100， Tween等。 ?（ enzymatic lysis） ： ? 外加酶法： ? 根據(jù)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成特點(diǎn)，選用適當(dāng)?shù)拿?。 ? 自溶法（ autolysis） : ? 細(xì)胞結(jié)構(gòu)在本身具有的各種水解酶作用下發(fā) ?生溶解的現(xiàn)象。 細(xì)胞對破碎方法的敏感性 ? 細(xì)胞 聲波 機(jī)械 滲透壓 凍融 ? ———————————————————— ? 動植物 +++ +++ +++ +++ ? 革蘭氏陰性菌 ++ ++ ++ ++ ? 革蘭氏陽性芽孢菌 ++ + ++ + ? 酵母 + + + + ? 革蘭氏陽性球菌 + + + ? 菌絲 ++ ++ ? 孢子 （三）細(xì)胞破碎確認(rèn) ： 破碎前，用顯微鏡或電子微粒計數(shù)器直接計數(shù)； 破碎后，用染色法區(qū)分破碎細(xì)胞與完整細(xì)胞。 ： 利用破碎前后導(dǎo)電率的變化測定破碎程度。 ： 測定破碎液中胞內(nèi)蛋白質(zhì)或目的酶的釋放量，估算破碎率。 三、酶的提取 (extraction) ? 把酶從生物組織或細(xì)胞中以溶解狀態(tài)釋放出來的過程，即將盡可能多的酶，盡量少的雜質(zhì)從原料中引入溶液。 ? 提取目標(biāo)： a. 將 目的酶最大限度地溶解出來。 b. 保持生物活性。 ? 注意：溫度升高，溶解度加大。但為防止酶失活， ? 一般 采用低溫下（ 0~10℃ ） 操作。 提取原則 ?a. 相似相溶。 ?b. 遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的 pH值，溶解度增加。 提取方法 ： （一）鹽溶液提取 常用稀鹽（常用 NaCl）溶液（鹽溶），對酶穩(wěn)定性好、溶解度大 ，最常用。 （二）酸、堿溶液提取 （三）有機(jī)溶劑提取 四、 離心分離 （ 一） 基本原理 1. 離心力 Fc = m ac ＝ m r ω2 ＝ m r （ 2? N/60） 2 N為離心機(jī) 每分鐘轉(zhuǎn)數(shù) （ r/min ）； Fc通常以相對離心力 RCF（ relative centrifugal force）表示，即離心力 F的大小相當(dāng)于地球引力（重力常數(shù) g）的多少倍。 一般用 g（或數(shù)字 ?g）表示。 RCF = m r （ 2? N/60） 2 /mg= ?105 N2 r 此公式描述了相對離心力與轉(zhuǎn)速之間的關(guān)系 旋轉(zhuǎn)半徑用 r平均 代替 r平均 =1/2（ r大 +r小 ） cm 通常： ?低速離心以 每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù) 表示，如： 4000r/min。 ?高速離心（超速），常以 相對離心力 （ RCF）表 示，如： 65000g。 兩者可換算或查測算圖。 計算近似RCF的列線圖 2. 沉降系數(shù) :（ sedimentation constant） 指單位離心力下顆粒的沉降速度（ sedimentation velocity） ,用 S表示 。 由于許多生物大分子的 S值很小，所以定義 10 ?13 s 為一個沉降單位， 1S = 1?10?13 s。 常用 S表示某些生物大分子、亞細(xì)胞及亞細(xì)胞器的大小，如 16sRNA，蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)一般在 1 ~ 200之間。 （二）離心機(jī)的種類 按離心機(jī)轉(zhuǎn)速的不同，分為： 常速（低速） 高速 超速 名稱 轉(zhuǎn)速 (r/min) 注意事項(xiàng) 低速離心機(jī) ?6000 常溫，注意樣品熱變性和離心管平衡 高速離心機(jī) 6000? 25000 冷凍（防止溫度升高）， 離心管的精確平衡 超速離心機(jī) 25000 冷凍＋真空系統(tǒng)（減少空氣阻力和摩擦）， 離心管的精確平衡 離心機(jī)的種類 實(shí)驗(yàn)室離心機(jī) ? 溫度類型： 常溫及冷凍 ? 超速離心機(jī)均為冷凍型。 ? 使用冷凍離心機(jī)時提前降溫，預(yù)冷離心頭。 ? 使用超速離心機(jī)時先抽真空。 離心的形式 ? 角式及外擺式：外擺式一般為低速， ? 角式由低速到超速均有。 角式離心機(jī)和離心頭（轉(zhuǎn)子） ? 角式離心頭要配套，低溫使用要預(yù)冷，操作注意穩(wěn)、蓋、旋緊。 離心機(jī)的大?。郝涞厥郊芭_式 小臺式離心機(jī) 離心管 ? 材質(zhì)：玻璃，塑料 ? 強(qiáng)度：和離心速度相配 ? 大小：和轉(zhuǎn)子配套 ? 高速超速管要加蓋 離心機(jī)操作 ? 平衡、定溫、定速、定時。 （三）常用離心方法 差速離心法 沉降速度法 密度梯度離心 沉降平衡法 等密度梯度離心 1．差速離心 （ differential centrifugation） 采用不同的離心速度和離心時間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法 。 特點(diǎn)： 用于分離大小和密度差異較大的顆粒。 優(yōu)點(diǎn)： 操作簡單 。 缺點(diǎn)： 1） 分離效果較差， 不能一次得到純顆粒。 2）壁效應(yīng)嚴(yán)重。 3）沉降的顆粒受到擠壓 。 差速離心分離示意圖 （ a）離心前的懸浮液 （ b）～（ e）離心不同時間后顆粒的沉降情況 2．密度梯度離心 （ density gradient centrifugation） 樣品在 密度梯度介質(zhì) 中進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)比較接近的組分得以分離的一種區(qū)帶分離方法。 常用的密度梯度溶液是 蔗糖 溶液。 特點(diǎn)： ?區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度小于樣品物質(zhì) 顆粒的密度。 ?適宜分離密度相近而大小不同的固相 物質(zhì) 。 密度梯度離心示意圖 （ a）離心前 （ b）離心后 Density gradient ultracentrifugation 密度梯度離心 步驟： B. 加樣 3. 等密度梯度離心 又 稱 沉降平衡離心 （ sedimentation equilibrium centrifugation）。 根據(jù) 顆粒的密度不同 而進(jìn)行分離。 離心時，在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)，不同密度的物質(zhì)顆粒或向下沉降，或向上漂浮，達(dá)到與其相同的密度時不再移動，形成區(qū)帶。 常用 氯化銫 （ CsCl）作為梯度介質(zhì)。 特點(diǎn)： ?介質(zhì)的密度梯度范圍包括所有待分離物質(zhì)的密度。 ?適于分離沉降系數(shù)相近，但密度不同的物質(zhì)。 等密度梯度離心示意圖 （ a）離心前； （ b）離心后 密度梯度離心 等密度梯度離心 梯度介質(zhì) 通常用蔗糖 最大的梯度密度 最小密度的沉降樣品 通常用 CsCl 最大的梯度密度 密度最大的沉降樣品 離心條件 在最前的沉降物質(zhì)達(dá)到管底前停止，短時間，低速度 使各組分沉降到其平衡的密度區(qū)，長時間，高速度 分離依據(jù) 密度相近，但沉降系數(shù)不同 沉降系數(shù)相近，但密度不同 沉降速度離心和沉降平衡離心的特點(diǎn) 總結(jié) ： ?等密度梯度離心 是一種測定顆粒浮力密度的靜力學(xué)方法，關(guān)鍵在于選擇氯化銫濃度，使之包括待分離物的密度范圍。 ?差速離心 是一種動力學(xué)方法，關(guān)鍵在于選擇適合于各分離物的離心力。 ?密度梯度離心 兼有以上兩種方法的特點(diǎn)，關(guān)鍵在于制備優(yōu)質(zhì)的密度梯度溶液。 （四）應(yīng)用 根據(jù)不同離心目的，分為 ?制備性離心： 分離純化和制備 ?分析性離心： 測分子量、沉降系數(shù)、密度、純度 五、沉淀分離（根據(jù)溶解度的不同） ?使溶液中的溶質(zhì)由液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔辔龀? ?古老、實(shí)用、簡單的初步分離方法 ?在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法： ? ⑴中性鹽沉淀（鹽析法） ? ⑵有機(jī)溶劑沉淀 ? ⑶選擇性沉淀（熱變性和酸堿變性） ? ⑷等電點(diǎn)沉淀 ? ⑸有機(jī)聚合物沉淀 （一）鹽析沉淀法（改變離子強(qiáng)度） 1. 基本原理（鹽溶和鹽析） 向蛋白質(zhì)或酶的水溶液中加入中性鹽，可產(chǎn)生兩種現(xiàn)象： 1) 鹽溶 （ salting in） ： 低濃度的中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度。 2) 鹽析 （ salting out） ： 高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度。 蛋白質(zhì)的鹽析 硫酸銨對馬血紅蛋白的溶解度的影響 離子強(qiáng)度 鹽 析 鹽溶 原因： 高鹽濃度下鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭奪水分子，除去蛋白質(zhì)的水合外殼，降低溶解度而沉淀。 不同蛋白質(zhì)分子量、表面電荷不同，在不同鹽濃度下沉淀， 逐漸增大鹽濃度，不同蛋白質(zhì)先后析出，稱分段鹽析。 蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)域和荷電區(qū)域 ?