【正文】 固定化酶與固定化細(xì)胞技術(shù) 王海磊 河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 AEM室 2. 酶在應(yīng)用中受到的限制因素： 1. 酶作為 :生物 催化劑的優(yōu)點(diǎn) ① 穩(wěn)定性差，易失活 ② 反應(yīng)速度隨時(shí)間減慢（ 3分鐘內(nèi)吸光度的變化） ③ 回收困難（淀粉酶水解廢棄淀粉） ④ 經(jīng)濟(jì)上不合算： 多不能重復(fù)使用。 ⑤ 一些酶價(jià)格昂貴（漆酶用于木板粘合） ① 反應(yīng)專一性強(qiáng)。 ② 催化效率高（比一般催化劑高 1071013倍）。 ③ 反應(yīng)條件溫和（常溫常壓）。 （ 1） 人工合成酶： 應(yīng)用化學(xué)合成法合成具有像酶那樣活性的催化劑。這是有機(jī)合成和聚合化學(xué)中的最新技術(shù)。但距實(shí)際應(yīng)用還有很大距離。 （ 2） 酶的人工“改性”、“修飾”： 酶和細(xì)胞固定化是其中的一類。其它如基因工程、化學(xué)修飾等方法。 3. 克服上述限制性因素的途徑： ? 難得的報(bào)道：人工合成脂肪酶獲得成功 ? 隨著生物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，人類對(duì)環(huán)境逐步認(rèn)識(shí)，酶的廣泛用途越來(lái)越得到人類的重視，尤其脂肪酶，在日化洗滌劑領(lǐng)域、醫(yī)藥美容領(lǐng)域、能源領(lǐng)域生物柴油生產(chǎn)中顯得無(wú)可替代的優(yōu)勢(shì)。一般脂肪酶生產(chǎn)主要來(lái)源于發(fā)酵微生物生產(chǎn)法獲得，產(chǎn)量受到限制，成本較高，很難滿足工業(yè)需求。關(guān)于人工合成脂肪酶在中國(guó)乃至世界未曾有過相關(guān)報(bào)道。 經(jīng)過不懈努力，我公司通過人工合成的手段獲得成功，實(shí)屬國(guó)際首例。經(jīng)檢驗(yàn)它不僅具備生物酶的通性，具有生物酶的全效功能，而且其催化性能、環(huán)境要求、毒化耐性各項(xiàng)指標(biāo)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通生物酶。生產(chǎn)成本不足普通酶的三分之一，而且不受產(chǎn)量的局限，可大規(guī)模投入生產(chǎn)。 ? 石家莊市華北聯(lián)化科技有限公司 第一節(jié) 固定化酶 （ Immobilized Enzyme） 一、發(fā)展概況 (1) 1916， Nelson和 Griffin發(fā)現(xiàn)蔗糖酶結(jié)合于骨炭末上仍具有活力，但未引起人們重視。 (2) 1950前，研究不多，不超過 10篇相關(guān)論文。有目的開展固定化研究始于 50年代。 1953， Grubhofer和 Schloith將聚氨基聚苯乙烯樹脂重氮化后與淀粉酶、蛋白酶結(jié)合 —— 最早固定化酶 (3)60年代進(jìn)展較快：固定化酶投入工業(yè)化生產(chǎn)。 (4)70年代為快速發(fā)展時(shí)期。 固定化酶： 連接于某種載體上或者限制在一定空間范圍內(nèi)、能連續(xù)使用的酶。 二、制備固定化酶的原則 保持酶原有專一性、高效催化能力和常溫常壓下起催化反應(yīng)的特點(diǎn)。制備盡可能在溫和條件下進(jìn)行（低溫、最適 pH、水溶液中）。 能回收、貯藏和反復(fù)使用－酶和載體結(jié)合牢固性問題。 有一定機(jī)械強(qiáng)度，以利于機(jī)械化、自動(dòng)化操作。 酶與載體結(jié)合部位應(yīng)避開活性中心及與維持酶高級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)的基團(tuán)。且在制備過程盡可能保護(hù)這些基團(tuán)。 最小的空間位阻：載體盡可能地不阻礙與底物的接近。 穩(wěn)定性：載體不與底物、產(chǎn)物和反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 易與產(chǎn)物分離，便于回收和重復(fù)使用。 盡量降低成本。 三、固定化酶的制備方法 物理法 : 吸附法、包埋法 化學(xué)法 : 交聯(lián)法、化學(xué)共價(jià)法 綜合法 : 逆膠束包囊法 （一）吸附法 采用固體吸附劑將酶吸附在它的表面使之固定的方法。 （ 1）無(wú)機(jī)吸附載體： 礦物質(zhì)和其它無(wú)機(jī)載體。 ? 高嶺土 ：胰凝乳蛋白酶 ? 皂土 ： 過氧化氫酶、核糖核酸酶 ? 氧化鋁：葡萄糖氧化酶 ? 二氧化硅（覆蓋卵磷脂 /腦磷脂）：酸性磷酸酯酶、磷酸葡萄糖變位酶。 ? 不銹鋼：直徑 100200粒子，以氧化鈦處理，可吸附 β半乳糖苷酶（ 17mg/g載體）。 載體類型 9 高嶺土 性質(zhì)：良好粘結(jié)性 粒度和細(xì)度 較強(qiáng)結(jié)合能力 離子吸附性及交換性 瓷土 ，現(xiàn)在世界上都把它叫做“高嶺土”，在很久很久以前，高嶺村有一家姓盛的窮苦夫妻，日子苦得就像黃連一樣。 盛家夫妻心地卻特別善良。有一年冬天，天氣寒冷，屋檐下躺著個(gè)白發(fā)蒼蒼的老公公，盛家妻子端來(lái)了一碗熱開水，送到那老公公跟前，請(qǐng)他喝下暖暖身子。妻子借來(lái)米，男人生火熬粥，一會(huì)兒工夫，一大碗香噴噴，熱騰騰的米粥端到了老公公的面前。老公公見了，也不客氣，一口氣就把粥喝了下去。 我沒有什么好報(bào)答你們，我走后，可到村后東南面的 松山 頂上一口氣挖它個(gè)九九八十一鋤，老公公早已不見蹤影。 軟乎乎得就像糯米粉一樣：“松山頂上的石頭，可以拿來(lái)做瓷器，做成的瓷器能跟玉器一樣的值錢哩！” 將挖起的土石做成一個(gè)個(gè)碗和杯的坯子來(lái)，放進(jìn)窯里一燒，果然個(gè)個(gè)晶瑩潔白，真象玉器一樣。 從此，高嶺村的窮人們?cè)谑⒓曳蚱薜膸ьI(lǐng)下，改行挖土建窯燒瓷器了。松山因地處高嶺，就改名叫 高嶺山 ，山上的瓷土，就叫做高嶺土了。 10 皂土： 膨潤(rùn)土 、火山黏土。 皂土是由天然膨潤(rùn)土精制而成的無(wú)機(jī)礦物凝膠。膨潤(rùn)土一般是指主 要由蒙脫土組成的一種黏土巖。皂土的主要有效成分即為蒙脫土， 含量大約 90%。 蒙脫石是由兩個(gè)硅氧四面體夾一層鋁氧八面體膨潤(rùn)土組成的 2:1型晶體結(jié)構(gòu)，由于蒙脫石晶胞形成的層狀結(jié)構(gòu)存在某些陽(yáng)離子 如 Cu、 Mg、 Na、 K等 ,且這些陽(yáng)離子與蒙脫石晶胞的作用很不牢 固，易被其它陽(yáng)離子交換，故具有較好的離子交換性 。 （ 2）有機(jī)吸附載體 纖維素粉：糖苷水解酶 火棉膠 ：木瓜蛋白酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖6磷酸脫氫酶（ 70mg酶蛋白 / cm2） ) （ 3）離子交換劑作為吸附載體 CM纖維素、 DEAE（二乙胺基乙基） 纖維素、 DEAE葡聚糖。 人工合成的陰離子、陽(yáng)離子交換樹酯。由苯乙烯、二乙烯合成的聚合物。 陽(yáng)離子型：磺酸、磷酸、 COOH、酚基等基團(tuán) 陰離子型： 季胺、仲胺、伯胺基團(tuán)。 ? 火棉膠： 硝化棉溶液；硝化纖維素：用一種天然膠或合成膠增塑的樹脂與之相結(jié)合 ,通過溶劑蒸發(fā)而干燥后制成的材料。 對(duì)眼睛、呼吸道粘膜有刺激作用。經(jīng)呼吸道和消化道進(jìn)入人體，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)。人接觸后有咽喉痛、頭痛、嗜睡、精神遲鈍、腹痛、嘔吐、皮膚及眼結(jié)膜充血、疼痛。本品極易燃。遇明火、高熱、氧化劑或胺能引起燃燒爆炸。長(zhǎng)期貯存能自燃。 CM纖維素 CM－ cellulose 即羧甲基纖維素（carboxymethyl cellulose）為陽(yáng)離子交換纖維素之一。 影響因素 (1)pH： pH變化影響載體和酶蛋白的電荷，從而影響酶的吸附。一般在蛋白的等電點(diǎn)時(shí)可達(dá)最大吸附。 (2) 鹽：影響復(fù)雜。一般會(huì)阻止吸附。 實(shí)際上已被用來(lái)洗脫從低鹽溶液吸附的酶。個(gè)別情況可促進(jìn)蛋白的吸附于原來(lái)不吸附的惰性支持物上。 (3) 溫度：隨溫度升高而增加吸附量。但酶失活會(huì)加速 (4)載體：與載體表面積、多孔度、載體預(yù)處理有關(guān)。顆粒越小則吸附越好。多孔載體與孔的大小和表面積有關(guān)。另外載體的預(yù)處理是極為重要的：有的載體會(huì)影響酶的結(jié)合量、有的會(huì)引起酶變性、有的會(huì)降低酶的活性。例如多孔硅，其表面有較高的酸性而易使酶變性，需要用緩沖液進(jìn)行予處理。 吸附法優(yōu)缺點(diǎn) (1) 優(yōu)點(diǎn) ① 操作簡(jiǎn)單