蛋白組學(xué)二維電泳ppt課件(已修改)
2025-05-19 13:46 本頁面
【正文】 蛋白質(zhì)組學(xué) 浙江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 江 輝 密碼： shenghua 第二章 二維電泳與蛋白質(zhì)分離 ? 一、蛋白質(zhì)的提取與樣品制備 ? 二、二維等電聚焦 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳維等電聚焦電泳 ? 三、膠上蛋白質(zhì)檢測技術(shù) 蛋白質(zhì)染色方法 ? 膠內(nèi)：考馬斯亮藍(lán) R250 (CBB R250)、 CBB G250、銀染、負(fù)染、熒光染料染色以及放射性同位素標(biāo)記等 ? 轉(zhuǎn)移到膜（ PVDF、硝酸纖維素膜）上：酰胺黑 (Amido Black)、麗春紅 S(Ponceau S) （一）考染（考馬氏亮藍(lán)染色） ? 考馬氏亮藍(lán)與蛋白質(zhì)反應(yīng)機(jī)理 考馬氏亮藍(lán)（ Coomassie brilliant blue）是一類三苯基甲烷衍生物。分為 R250（紅蘭色）、 R350 （紅蘭色） 、 G250（藍(lán)綠色），它們與蛋白質(zhì)結(jié)合生成深藍(lán)色復(fù)合物，在 464595nm有吸收峰（ 595nm 最大），且在比較寬的范圍內(nèi)（ 1520 μg ）掃描峰的面積與蛋白質(zhì)量成線性關(guān)系，因此可在595nm對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量檢測，而且在一定 pH條件下，這種染料 蛋白質(zhì)復(fù)合物被完全解聚。 ? 考染機(jī)理 膠體內(nèi)染料和溶液中自由擴(kuò)散染料間形成平衡后，溶液中少量自由染料穿透凝膠基質(zhì)，有選擇性地對蛋白質(zhì)進(jìn)行染色，而膠體態(tài)的染料排阻在膠外，阻止了背景的生成。膠內(nèi)蛋白質(zhì)染色的關(guān)鍵是讓蛋白質(zhì)染色，而膠體不染色。 Coommassie Brilliant Blue G250 考染程序 ? 考染程序至少 600多種，主要變換是將以下程序中的醋酸換成三氯乙酸、磷酸或高氯酸，但三氯乙酸易使谷氨酸羧基側(cè)鏈不可逆酯化，造成肽譜數(shù)
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