dna操作技術ppt課件(已修改)
2025-05-17 12:09 本頁面
【正文】 第四章 DNA操作技術 學習內容： DNA操作酶 – 核酸酶 – 連接酶 – 聚合酶 – DNA修飾酶 限制性內切酶 – 分類和命名 – 酶切體系、反應條件、結果鑒定 – 定位酶切位點 連接 1. DNA操作酶 核酸酶：剪切、縮短、降解核酸 – Bal31 – E. coli外切酶 III – S1 內切酶 – DNase I – RNase H 連接酶：連接核酸分子 聚合酶：復制 修飾酶：增加或去除化學基團 拓撲異構酶：引入或去除超螺旋的閉合環(huán)狀 DNA 核酸酶 作用：降解 磷酸二酯鍵 分為： 外切酶 內切酶 核酸酶 Bal 31(來自于細菌 Alteromonas espejiana) 單鏈特異的核酸內切酶活性，雙鏈特異的內切酶活性。 依賴于 Ca2+ 用途： 構建限制酶圖譜 產(chǎn)生末端缺失突變 DNA超螺旋線性化 核酸酶 E. coli外切酶 III 只降解 DNA分子 的一條鏈，產(chǎn)生 單鏈的 DNA分子。 核酸酶 來自于真菌 Aspergillus oryzae 的S1內切酶 作用于單鏈 DNA或 RNA。 ,Zn2+ 用途： 分析內元的位置 獲得平端 dsDNA 酶量大時， 降解雙鏈 DNA 核酸酶 來自于牛胰腺的 DNase I既可以降解單鏈也可以降解雙鏈，沒有特異性，產(chǎn)生單核苷酸或短鏈。 核酸酶 RNase H（ E. coli） –降解 RNA:DNA雜交分子中的 RNA。 連接酶 廣泛存在于各種生物中，連接 3‘端羥基和 5’端磷酸形成磷酸二酯鍵。在 DNA復制、修復、以及 體外重組 過程中起 重要作用。 連接酶 T4DNA連接酶 –連接粘性末端、平端 –修復雙鏈 DNA或 RNADNA雜交雙鏈上的缺口。 E. coli DNA連接酶 –連接粘性末端（主要用于 cDNA第二鏈的合成） T4RNA連接酶 聚合酶 依賴 DNA的 DNA聚合酶 不依賴 DNA的 DNA聚合酶（末端轉移酶） 依賴 RNA的 DNA聚合酶（反轉錄酶） 依賴 DNA的 RNA聚合酶 不依賴 DNA的 RNA聚合酶 聚合酶 DNA聚合酶 I –5’3’聚合酶活性 –3’5’外切酶活性 –5’3’外切酶活性 –核酸內切酶活性 可以被枯草桿菌蛋白酶水解成：Klenow片段和 N端具 5’3’外切酶活性的分子。 聚合酶 聚合酶 Klenow酶 –修復限制性內切酶造成的粘端 –標記 DNA探針 –催化 cDNA第二條鏈的合成 –末端終止法測序 聚合酶 T4 DNA聚合酶 –與 Klenow酶相似，外切酶活性更高。體外誘變反應中效率很高。 T7 DNA聚合酶 –測序酶 Taq DNA聚合酶 聚合酶 逆轉錄酶 ：將 mRNA轉錄成 cDNA –AMV逆轉錄酶（鳥類成髓細胞性白血病病毒） DNA聚合酶活性 RNase H活性 DNA內切酶活性 核酸結合活性 –MMLV逆轉錄酶（ Moloney鼠白血病病毒） DNA修飾酶 堿性磷酸酯酶 （來自于大腸桿菌或小牛腸道）可以去掉 DNA分子的 5‘端的磷酸基團。 polynucleotide
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