基因與載體連接ppt課件(已修改)
2025-05-15 22:02 本頁面
【正文】 第六章 基因與載體連接 一、黏性末端與平末端的連接 二、其他連接方法 一、黏性末端與平末端的連接 一）黏性末端 DNA分子間的連接 DNA連接酶把相互靠近的 5’端磷酸與 3’OH連到一起。 1. 兩段 DNA的連接 依靠粘性末端 依靠粘性末端 2. DNA片斷與載體的連接 nick ligase 3. 4 . 粘性末端的更換 在 DNA片段上某一酶切口處換成另一種酶切口 二 ) 平末端（ blunt end）的連接 5’端與 3’端并列靠近的時間太短，不容易被連接酶連接。 1. 直接連接 T4DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的 1%。 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ OH OH P P P P HO HO 5’ 3’ OH P P HO 5’ 3’ 1972年，斯坦福大學的 P. Labban和 P. Kaiser提出。 （ 1）同聚物加尾 法 2. 人工加尾形成 “ 粘性末端 ” DNA末端轉(zhuǎn)移酶 能在沒有模板的情況下給 DNA的 3’OH端 加上脫氧核苷酸。 ① 原理： 分別給載體和插入片斷加上 互補的 核苷酸。 ② 加尾 — 堿基互補 ④ 缺點： ③ 優(yōu)點： 能把任何片段連接起來 不能把插入片段再切下來。 非酶切位點 5‘突出的末端 外源片段先用 Klenow補平；然后用 TdT補加 polyC；載體片段也用 Klenow補平，加 polyG，退火不經(jīng)連接即可轉(zhuǎn)化。目的是：不使酶切位點遭受破壞。 5 ‘ 3 ‘ 3
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