雙向電泳原理及實(shí)驗(yàn)步驟(已修改)
2025-05-11 04:57 本頁(yè)面
【正文】 蛋白質(zhì)組雙向電泳 實(shí)驗(yàn)操作 1994年 ， 澳大利亞 Macquarie大學(xué)的 Wilkins和 Williams首先提出了蛋白質(zhì)組 （ Proteome）的概念 ， 其定義為在一種細(xì)胞內(nèi)存在的全部蛋白質(zhì) 。 蛋白質(zhì)組研究中主要應(yīng)用的技術(shù)包括：雙相電泳 (2DE)、 新型質(zhì)譜 (MS)技術(shù) 、 數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)置與檢索系統(tǒng)等 。 蛋白質(zhì)組分析的首要要求 ? 將來(lái)自于全細(xì)胞、組織或生物體中所包含的多達(dá)幾千種混合蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、檢測(cè)和分析 。 ? 2DE技術(shù)依然是大多數(shù)蛋白質(zhì)組研究中分離復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物的首選技術(shù) 。 生物學(xué)問(wèn)題的提出 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣品的制備 蛋白樣品的 IEF和 PAGE電泳分離 圖像掃描和初步分析 感興趣蛋白點(diǎn)的切取 胰酶對(duì)脫色后蛋白質(zhì)的消化 質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測(cè)序分析 質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學(xué)分析和比對(duì) 新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn) 其它實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證 蛋白信息的初步獲得 蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)路線 蛋白質(zhì)樣品的制備 雙向電泳 圖像分析 轉(zhuǎn)印至膜上的蛋白 凝膠中的蛋白 溶液中的蛋白 混合肽 蛋白質(zhì)質(zhì)量 N端測(cè)序 肽序列質(zhì)譜數(shù)據(jù) 肽指紋圖 數(shù)據(jù)搜索 新的或已知蛋白 蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾的鑒定 一、雙向電泳的實(shí)驗(yàn)原理 + – pH 3 pH pH 10 + – pH 3 pH pH 10 + – pH 3 pH pH 10 + – pH 3 pH pH 10 第一向：等電聚焦 一維固相 pH梯度等電聚焦 （ IEF with IPG）： ? IPG膠的材料是 Immobilines，為擁有 CH2=CHCONHR結(jié)構(gòu)的 8種 丙烯酰胺衍生物 系列，其中 R包含羧基或叔氨基團(tuán)，它們構(gòu)成了分布在pH310不同值的緩沖體系。根據(jù)公布的配方計(jì)算后，將適宜的 IPG試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中緩沖基團(tuán)通過(guò)乙烯鍵共價(jià)聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成 pH梯度。通過(guò)這種方式生成的 IPG不會(huì)發(fā)生電滲透作用，因而可以進(jìn)行特別穩(wěn)定的 IEF分離達(dá)到真正的平衡狀態(tài)。 – charge size 第二向： SDSPAGE電泳 Proteins migrate through the gel at a rate proportional to their size. Smallest proteins travel the furthest distance + pH 3 pH pH10 樣品制備基本原則 ? 使所有待分析的蛋白樣品全部處于 溶解狀態(tài) （包括多數(shù)疏水性蛋白），制備方法應(yīng)具有 可重現(xiàn)性 。 ? 防止樣品在聚焦時(shí)發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。 ? 防止在樣品制備過(guò)程中發(fā)生樣品抽提后的化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。 ? 完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。 ? 盡量去除起干擾作用的高豐度或無(wú)關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測(cè)性。 樣品制備 ? 細(xì)胞樣品：反復(fù)凍融、超聲破碎 ? 組織樣品：碾磨、勻漿 ? 植物樣品：碾磨 ? 分泌蛋白 蛋白質(zhì)樣品的濃縮、去除濾液中的高豐度蛋白 ? 菌體蛋白 裂解液處理、超聲破碎 可溶性樣品 固體組織樣品 細(xì)胞 不同樣品的基本處理方法 樣品的分級(jí)處理 通過(guò)采用亞細(xì)胞分級(jí)、液相電泳和選擇性沉淀等方法對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分級(jí)處理，可降低樣品的復(fù)雜性并富集低豐度蛋白質(zhì)。當(dāng)前最簡(jiǎn)單有效的處理是采用分級(jí)抽提，按樣品溶解度不同進(jìn)行分離。 雙向電泳樣品的溶解 ? 是成功進(jìn)行雙向電泳的最關(guān)鍵因素之一 ? 溶解的目標(biāo)： – 樣品中非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚積體完全破壞，從而形成各個(gè)多肽的溶解液； – 必須允許可能干擾 2DE分離的鹽、脂類、多糖和核酸等物質(zhì)的去除； – 保證樣品在電泳過(guò)程中保持溶解狀態(tài)。 增加樣品溶解性的手段 離液劑 ： 通過(guò)改變?nèi)芤褐械臍滏I結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。典型代表是尿素和硫尿。 去垢劑 ： 經(jīng)過(guò)離液劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)后，還常需至少一種去垢劑來(lái)溶解疏水基團(tuán)。常用的去垢劑有離子去污劑 SDS、非離子去污劑
公司管理相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1