【正文】 第十四章 色譜法分離原理 第一節(jié) 概述 色譜法是一種重要的分離分析方法，它是根據(jù)組分在兩相中作用能力不同而達(dá)到分離目的的。1 色譜法早在 1903年由俄國植物學(xué)家 茨維特 分離植物色素時(shí)采用。 他在研究植物葉的色素成分時(shí)，將植物葉子的萃取物倒入填有碳酸鈣的直立玻璃管內(nèi)，然后加入石油醚使其自由流下，結(jié)果 色素中各組分互相分離形成各種不同顏色的譜帶 。這種方法因此得名為 色譜法 。以后此法逐漸應(yīng)用于無色物質(zhì)的分離， “ 色譜 ” 二字雖已失去原來的含義，但仍被人們沿用至今。2ts31941 Martin和 Synge提出液 液色譜理論；1952 James和 Martin發(fā)展了氣相色譜；1956 Van Deemter提出速率理論；1967 Kirkland等研制高效液相色譜法；80年代以后 出現(xiàn)毛細(xì)管電泳和毛細(xì)管電動色譜等一系列新的色譜分析方法。4 n在色譜法中，將填入玻璃管或不銹鋼管內(nèi)靜止不動的一相（固體或液體）稱為 固定相 ；n自上而下運(yùn)動的一相（一般是氣體或液體）稱為 流動相 ；n裝有固定相的管子（玻璃管或不銹鋼管）稱為 色譜柱 。5n當(dāng)流動相中樣品混合物經(jīng)過固定相時(shí)，就會與固定相發(fā)生作用，由于各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相相互作用的類型、強(qiáng)弱也有差異，因此在同一推動力的作用下，不同組分在固定相滯留時(shí)間長短不同，從而按先后不同的次序從固定相中流出。6從不同角度，可將色譜法分類如下：216。氣體為流動相的色譜稱為 氣相色譜（GC）根據(jù)固定相是固體吸附劑還是固定液（附著在惰性載體上的一薄層有機(jī)化合物液體），又可分為 氣固色譜（ GSC） 和氣液色譜（ GLC） 。7216。液體為流動相的色譜稱 液相色譜（ LC） 同理液相色譜亦可分為 液固色譜（ LSC） 和液液色譜（ LLC） 。216。超臨界流體為流動相的色譜為 超臨界流體色譜（ SFC） 。 隨著色譜工作的發(fā)展，通過化學(xué)反應(yīng)將固定液鍵合到載體表面，這種化學(xué)鍵合固定相的色譜又稱 化學(xué)鍵合相色譜（ CBPC） 。8216。利用組分在吸附劑（固定相）上的吸附能力強(qiáng)弱不同而得以分離的方法，稱為 吸附色譜法 。216。利用組分在固定液（固定相）中溶解度不同而達(dá)到分離的方法稱為 分配色譜法 。216。利用組分在離子交換劑（固定相）上的親和力大小不同而達(dá)到分離的方法，稱為 離子交換色譜法 。9216。利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透而達(dá)到分離的方法，稱為 凝膠色譜法或尺寸排阻色譜法。最近，又有一種新分離技術(shù)，利用不同組分與固定相（固定化分子）的高專屬性親和力進(jìn)行分離的技術(shù)稱為 親和色譜法 ，常用于蛋白質(zhì)的分離。103. 按固定相的外型分類216。固定相裝于柱內(nèi)的色譜法，稱為 柱色譜 。216。固定相呈平板狀的色譜，稱為平板色譜，它又可分為 薄層色譜和紙色譜 。114. 按照展開程序分類 按照展開程序的不同，可將色譜法分為 洗脫法 、 頂替法 、 和迎頭法 。167。 洗脫法也稱沖洗法 。工作時(shí)，首先將樣品加到色譜柱頭上， 然后用吸附或溶解能力比試樣組分弱得多的氣體或液體作沖洗劑 。由于各組分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被沖洗劑帶出的先后次序也不同，從而使組分彼此分離。流出曲線下圖12A B 這種方法能使樣品的各組分獲得良好的分離，色譜峰清晰。此外，除去沖洗劑后，可獲得純度較高的物質(zhì)。目前，這種方法是色譜法中 最常用 的一種方法。13167。 頂替法是將樣品加到色譜柱頭后 ，在惰性流動相中加入對固定相的吸附或溶解能力比所有試樣組分強(qiáng)的物質(zhì)為頂替劑（或直接用頂替劑作流動相），通過色譜柱，將各組分按吸附或溶解能力的強(qiáng)弱順序，依次頂替出固定相。 很明顯，吸附或溶解能力最弱的組分最先流出，最強(qiáng)的最后流出。頂替法的流出曲線如下圖14 此法適于制備純物質(zhì)或濃縮分離某一組分；其 缺點(diǎn)是經(jīng)一次使用后，柱子就被樣品或頂替劑飽和 ，必須更換柱子或除去被柱子吸附的物質(zhì)后，才能再使用。A B15167。 迎頭法是將試樣混合物連續(xù)通過色譜柱 ，吸附或溶解能力最弱的組分首先以純物質(zhì)的狀態(tài)流出，其次則以第一組分和吸附或溶解能力較弱的第二組分混合物，以此類推。流出曲線如下圖 該法在分離多組分混合物時(shí)，除第一組分外，其余均非純態(tài)，因此僅適用于從含有微量雜質(zhì)的混合物中切割出一個(gè)高純組分（組分 A）， 而不適用于對混合物進(jìn)行分離。 16分類分類按流動相分氣相色譜（ GC）液相色譜（ LC）超臨界流體色譜（ SFC）按機(jī)理分吸附色譜分配色譜離子交換色譜排阻色譜17按固定相在支持 體中的形狀分柱色譜平板色譜 紙色譜薄層色譜按分離效率分 經(jīng)典液相色譜高效液相色譜18第二節(jié) 色譜流出曲線及有關(guān)術(shù)語（一）色譜流出曲線和色譜峰 由檢測器輸出的信號強(qiáng)度對時(shí)間作圖，所得曲線稱為色譜流出曲線。曲線上突起部分就是色譜峰。 如果進(jìn)樣量很小，濃度很低，在吸附等溫線（氣固吸附色譜）或分配等溫線（氣液分配色譜）的線性范圍內(nèi)，則色譜峰是對稱的。1920（二）基線 在實(shí)驗(yàn)操作條件下， 色譜柱后沒有樣品組分流出時(shí)的流出曲線稱為基線 ，穩(wěn)定的基線應(yīng)該是一條水平直線。（三）峰高 色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直距離，以（ h） 表示。21 n 色譜流出曲線和色譜峰n 基線（ a）n 峰高（ h）信號進(jìn)樣 空氣峰 ha色譜流出曲線色譜峰22（四）保留值 tM 不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)進(jìn)入色譜柱時(shí)，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時(shí)間稱為死時(shí)間，它正比于色譜柱的空隙體積，如下圖 。信號 進(jìn)樣tM23因?yàn)檫@種物質(zhì)不被固定相吸附或溶解，故 其流動速度將與流動相流動速度相近。 測定流動相平均線速 ū時(shí)，可用柱長 L與 tM的比值計(jì)算，即ū=L/tM242.保留時(shí)間 tR試樣從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)峰極大點(diǎn)時(shí)所經(jīng)過的時(shí)間，稱為保留時(shí)間，如下圖。信號進(jìn)樣tR25 tR180。 某組分的保留時(shí)間扣除死時(shí)間后，稱為該組分的 調(diào)整保留時(shí)間 ， 即 tR180。=tR?tM 由于組分在色譜柱中的保留時(shí)間 tR包含了組分隨流動相通過柱子所需的時(shí)間和組分在固定相中滯留所須的時(shí)間， 所以 tR實(shí)際上是組分在固定相中保留的總時(shí)間。26保留時(shí)間是色譜法定性的基本依據(jù)， 但同一組分的保留時(shí)間常受到流動相流速的影響，因此色譜工作者有時(shí)用保留體積來表示保留值。27 V0 指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測器的空間的總和。當(dāng)后兩項(xiàng)很小可忽略不計(jì)時(shí)， 死體積可由死時(shí)間與色譜柱出口的載氣流速 Fco（ cm3min 1） 計(jì)算 。28V0=tMFco式中 Fco為扣除飽和水蒸氣壓并經(jīng)溫度校正的流速。 僅適用于氣相色譜 ，不適用于液相色譜 。295. 保留體積 VR 指從進(jìn)樣開始到被測組分在 柱后出現(xiàn)濃度極大點(diǎn) 時(shí)所通過的流動相的體積。保留時(shí)間與保留體積關(guān)系： VR= tR Fco 30 VR? 某組分的保留體積扣除死體積后，稱為該組分的調(diào)整保留體積。 VR?=VR?V0=tR?Fco31 r2,1 某組分 2的調(diào)整保留值與組分 1的調(diào)整保留值之比，稱為相對保留值。r2,1=tR2?/tR1180。=VR2?/VR1? 由于相對保留值只與柱溫及固定相性質(zhì)有關(guān)，而與柱徑、柱長、填充情況及流動相流速無關(guān)，因此，它在色譜法中，特別是在氣相色譜法中，廣泛 用作定性的依據(jù) 。32 在定性分析中，通常固定一個(gè)色譜峰作為標(biāo)準(zhǔn)（ s）， 然后再求其它峰（ i） 對這個(gè)峰的相對保留值，此時(shí)可用符號 ?表示，即 ?=tR?(i)/tR?(s) 式中 tR ?(i)為后出峰的調(diào)整保留時(shí)間，所以 ?總是大于 1的。相對保留值往往可作為衡量固定相選擇性的指標(biāo)，又稱選擇因子。 33 (五 ) 區(qū)域?qū)挾? 色譜峰的區(qū)域?qū)挾仁巧V流出曲線的重要參數(shù)之一，用于衡量柱效率及反映色譜操作條件的動力學(xué)因素。表示色譜峰區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ?三種方法 。34 ?即 峰寬的一半。 Y1/2即峰高一半處對應(yīng)的峰寬。它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系為 Y1/2=? Y即色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)上的切線在基線上截距間的距離。它與標(biāo)準(zhǔn)偏差 ?的關(guān)系是 Y = 4 ?3536從色譜流出曲線中，可得許多重要信息：(i) 根據(jù)色譜峰的個(gè)數(shù) ，可以判斷樣品中所含 組分的最少個(gè)數(shù)；(ii) 根據(jù)色譜峰的保留值 ，可以進(jìn)行定性分析；(iii) 根據(jù)色譜峰的面積或峰高 ，可以進(jìn)行定量分析；(iv) 色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾?，是評價(jià)色譜柱分離效能的依據(jù)；(v) 色譜峰兩峰間的距離 ，是評價(jià)固定相（或流動相）選擇是否合適的依據(jù)。37 色譜分析的 目的 是將樣品中 各組分彼此分離 ，組分要達(dá)到完全分離，兩峰間的距離必須足夠遠(yuǎn)，兩峰間的距離是由組分在兩相間的分配系數(shù)決定的，即與色譜過程的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。但是兩峰間雖有一定距離，如果每個(gè)峰都很寬，以致彼此重疊，還是不能分開。這些峰的寬或窄是由組分在色譜柱中傳質(zhì)和擴(kuò)散行為決定的，即與色譜過程的動力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。因此， 要從熱力學(xué)和動力學(xué)兩方面來研究色譜行為。 38（一）分配系數(shù) K和分配比 k K 分配色譜的分離是基于樣