實(shí)驗(yàn)基本技術(shù)ppt課件(已修改)
2025-05-11 00:24 本頁面
【正文】 實(shí)驗(yàn)基本技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)無菌操作技術(shù)消毒 (disinfection)和消毒劑 (disinfectant)滅菌 (sterilization)防腐 (antisepsis)和防腐劑抑菌 (bacteriostasis)和抑菌劑 (bacteriostatic)無菌 (asepsis)無菌技術(shù) /無菌操作 (antiseptic technique)【 培養(yǎng)前準(zhǔn)備 】 在開始實(shí)驗(yàn)前要 制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序 。有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點(diǎn)無誤后將其放置操作場所 (培養(yǎng)室、超凈臺 )內(nèi)，然后開始消毒。這可以避免開始實(shí)驗(yàn)后，因物品不全往返拿取而增加污染機(jī)會?！?操作野消毒 】 無菌培養(yǎng)室每天都要用 %的新潔爾滅拖洗地面 — 次 (拖布要專用 )，紫外線照射消毒 3050min，超凈工作臺臺面每次實(shí)驗(yàn)前要用 75％酒精擦洗。然后紫外線消毒 30min。在工作臺面消毒時(shí)切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時(shí)照射紫外線，消毒時(shí)工作臺面上用品不要過多或重疊放置，否則會遮擋射線降低消毒效果。 — 些操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用 75%酒精擦洗后置于臺內(nèi)同時(shí)紫外線消毒?！?洗手和著裝 】 原則上和外科手術(shù)相同。平時(shí)僅做觀察不做培養(yǎng)操作時(shí)，可穿著細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)紫外線照射 30min的清潔工作服。在利用超凈臺工作時(shí)，因整個(gè)前臂要伸入箱內(nèi)，應(yīng)著長袖的清潔工作服，并于開始操作前要用 75％酒精消毒手。如果實(shí)驗(yàn)過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽?！?火焰消毒 】 在無菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無菌工作時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒精燈。以后一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。 【 操作 】 進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。培養(yǎng)細(xì)胞的觀察１．肉眼觀察培養(yǎng)物顏色及混濁度２．倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)細(xì)胞計(jì)數(shù) 將血球計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上?！ ?將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。 靜置 3分鐘?！ ?鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算： 細(xì)胞數(shù) /ml＝ 4大格細(xì)胞總數(shù) / 410000 注意：鏡下偶見由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占 10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。v 根據(jù)細(xì)胞生長的恃點(diǎn)，傳代方法有 3種：v 1．懸浮生長細(xì)胞傳代v 離心法傳代：離心（ 1000轉(zhuǎn) /分 ）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。v 直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除 l／2一 2／ 3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。v 2．半懸浮生長細(xì)胞傳代（ Hela細(xì)胞）v 此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹v 打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。v 3．貼壁生長細(xì)胞傳代v 采用酶消化法傳代。常用的消化液有 ％ 的胰蛋白酶液。細(xì)胞傳代方法貼壁生長細(xì)胞傳代方法v 1 吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液v 2 加入 12 ml ％ 的胰蛋白酶液 (以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)）v 靜置 210 min（ 顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測）。v 3 吸 去 胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。v 4 用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。v 5 離心，細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)液制成懸液。v 5 吸取 1/10—1/40 細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。v 6 加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi)。v 7 將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。v 任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。v 在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做 細(xì)胞活力 ，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對
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