【正文】 A New Light on DNA 基因有限公司市場部 王小彬 Pyrosequecing技術(shù)在 SNP分析 \分子診斷 和甲基化研究中的應(yīng)用 一種全新的 DNA分析技術(shù)； 一套完整的實驗方案； 諸多領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用 …… Pyrosequencing Uppsala, Sweden, houses Pyrosequencing headquarters 瑞典的 Biotage公司致力于應(yīng)用其專利的 PyrosequencingTM技術(shù)，發(fā)展、制造和銷售全套應(yīng)用于遺傳分析的解決方案。他們的 PyrosequencingTM技術(shù)是一項通過酶級聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)進行的全新的革命性的序列分析技術(shù) ， 它獨特的技術(shù)原理，高度精確可靠的結(jié)果，簡便的實驗操作，使得其該公司在 DNA分析領(lǐng)域處于領(lǐng)先地位，并在全世界范圍得到了廣泛的認同。他們的產(chǎn)品在眾多制藥、生物技術(shù)和農(nóng)業(yè)生物技術(shù)公司以及著名的學院和研究所被廣泛地采用。 一 . 什么是 Pyrosequencing？ ?一種新型的基于酶級聯(lián)反應(yīng)的新型測序技術(shù) ?Sanger法測序 PPi ATP Principle of Pyrosequencing Detection of the light light time Nucleotides dispensed sequentially 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0 1 A A G C T G The sequence in this pyrogram? is AGGCAG A GG C A G 二 . Pyrosequencing技術(shù)的流程 PCR產(chǎn)物 試樣預(yù)處理，獲得 PCR單鏈 Pyrosequencing序列分析 15 min/96 sample SQA:35 min/96 sample SNP: 10min/96 sample 12h /96 sample 遺傳變異 突變檢測 序列分析 定量分析 ?遺傳作圖 ?品種鑒定 ?病菌鑒定 ?克隆檢驗 ?... ?等位基因頻率分析 (AQ) ?單點或多個 SNP頻率分析 ?插入 /缺失頻率分析 ?雜和性缺失 ?CpG甲基化 ?多倍體基因組 ?SNP ?Biallelic SNPs ?Tri and tetraallelic SNPs ?Multiple SNPs ?Multiplexing ?Haplotyping 三 . PSQ? 96MA functionality ?已知位點 ?熱點區(qū)域內(nèi)的未知位點 ?點突變 ?插入 /缺失 ?多重突變 ?多路分析 臨床微生物研究 快速病毒、細菌的分型與鑒定 1. 炭疽熱（ Bacillus anthracis）細菌的快速鑒定與毒性分析 2. 百日咳桿菌和副百日咳桿菌的快速鑒定和分型 3. 幽門螺旋桿菌（ Helicobacter pylori）快速鑒定與抗藥性分析 4. Pyrosequencing技術(shù)用于革蘭氏陽性菌的鑒定 5. 李斯特桿菌（ Listeria monocytogenes） 的檢測和鑒別 6. 丙肝病毒的基因型研究 7. 快速監(jiān)控 HIV 病毒對蛋白酶抑制劑的不同抗性 ... ... 見 Pyrosequencing 快速 DNA分析系統(tǒng)在 CDC系統(tǒng)中的應(yīng)用 Target multiple anisms with one primer set CGGATGAGTTGGCTGGGCGGCCGCGGCTCGTATCCCGAGTCGAGGAAAGTCCGGACTTCACAGAGCAGGGTGAT CGGATGAGTTGGCTGGGCGGCCGCGGCTCGCGTAGGGCTTGTGTGGATTCACGAGGTTCAGCGTCGAGTCGAGGAAAGTCCGGACTTCACAGAGCAGGGTGAT CGGATGAGTTGGCTGGGCGGCCGCGGCTCGCGTAGGGCTTGTGTGGATTCACGAGGTTCAGCGTCGAGTCGAGGAAAGTCCGGACTTCACAGAGCAGGGTGAT CGGATGAGTTGGCTGGGCGGCCGCGGCTCGCGTAGGGCTTGTGTGGATTCACGAGGTTCAGCGTCGAGTCGAGGAAAGTCCGGACTTCACAGAGCAGGGTGAT CGGATGAGTTGGCTGGGCGGCCGCGGCTCGAGTCGGTTCGCAAGGACCGGCGCCGAGTCGAGGAAAGTCCGGACTTCACAGAGCAGGGTGAT CGGATGAGTTGGCTGGGCGGCCGCGGCTCGAGTTGGTTCGCAAGGATCGGCGCCGAGCCGAGGAAAGTCCGGACTTCACAGAGCAGGGTGAT CGGATGAGTTGGCTGGGCGGCCGCGGCTCGGGTTGGGCTCGTGTTATCACGAGTTCAGCGCCGAATCGAGGAAAGTCCGGACTTCACAGAGCTGGGTGAT CGGATGAGTTGGCTGGGCGGCCGCGGCCCGAGTCGGTCCGAGAGGTGCCGACTTGAGTCGAGGAAAGTCCGGACTTCACAGAGCAGGGTGAT CGGATGAGTTGGCTGGGCGGCCGCGGCTCGCGCCGGTCGAGAGTCCGGTGCCGAGTCGAGGAAAGTCCGGACTTCACAGAGCAGGGTGAT CGGATGAGTTGGCTGGGCGGCCGCGGCTCGTGTCGGTCTGAAAGTCCCGGTAACGAGTCGAGGAAAGTCCGGACTTCACAGAGCAGGGTGAT CGGATGAGTTGGCTGGGCGGCCGCGGGCCGTCGCAAGGCGGTTCGAGGAAAGTCCGGACTTCACAGAGCAGGGTGAT CGGATGAGTTGGCTGGGCGGCCGCGGCTCTCCCTGGTCCGCAGGACCATGCGAGTCGAGGAAAGTCCGGACTTCACAGAGCAGGGTGGT CGGATGAGTTGGCTGGGCGGCCGCGGCTCGTTTCGGCGAGTCGAGGAAAGTCCGGACTTCACAGAGCAGGGTGGT CGGATGAGTTGGCTGGGCGGCCGCGGCACCGGTGCAAACCGGGGTCGAGGAAAGTCCGGACTTCACAGAGCGGGGTGAT CGGATGAGTTGGCTGGGCGGCCGCGGCATCGCCTGATGTCGAGGAAAGTCCGGACTTCACAGAGCAGGGTGAT Forward CGGATGAGTTGGCTGGGC Reverse GACTTCACAGAGCHGGGTGYTTT Sequence CTGGGCGGCCGCGG PCR forward PCR reverse Sequence primer 16個臨床上非常重要的鏈球菌 rnpB基因 p3區(qū)域 ? Identification ? Risk for cancer Conserved region H. pylori specific region Conserved region 16S rRNA gene 23S rRNA gene ? Resistance/sensitivity A2143G A2142G + 3954 511 31 IL1beta gene All analyses can be run on one plate Versatility – Helicobacter pylori 1, Pyrosequencing公司和 Cleveland Clinic Foundation合作 ,研究引起肺結(jié)核等疾病的分支桿菌 (mycobacteria)的快速鑒定方法 2, Pyrosequencing公司和 Scottish Meningococcus and Pneumococcus Reference Laboratory, Stobhill Hospital, Glasgow, Scotland合作 ,研究引起腦膜炎和敗血病的細菌 Neisseria meningitidis (N. meningitidis) 的快速精確的鑒定和分型 ,包括SNPs和 short sequence stretches 3, Pyrosequencing公司和 Clinical Bacteriology, Uppsala University, Sweden合作 ,研究幽門螺旋桿菌 (Helicobacter pylori), 肺結(jié)核分支桿菌 (Mycobacterium tuberculosis)和炭疽熱細菌(Bacillus anthracis)的 快速鑒定和檢測及細菌耐藥性 Pyrosequencing測序數(shù)據(jù)的優(yōu)點 ? 方法獨特 ,可以鑒別野生型和突變型混合群體 ? 序列數(shù)據(jù)可以分辨不同的群體以