培訓(xùn)講義-修改后(已修改)
2025-04-28 22:38 本頁(yè)面
【正文】 實(shí)驗(yàn)一 植物核酸提取一、植物葉片總DNA的大量提取【實(shí)驗(yàn)原理】CTAB法原理CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨)，是一種陽(yáng)離子去污劑，具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強(qiáng)度的溶液中()，CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸。通過(guò)有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類(lèi)等雜質(zhì)后，加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來(lái)。TrisHCl ()提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl 提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNA充分溶解在液相中； CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。 【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹坷肅TAB法從植物葉片組織中提取高質(zhì)量DNA?！局饕噭?. CTAB提取緩沖液： NaCl，100mM Tris pH ，2% CTAB，20mM EDTA，% NaHSO3，2% β巰基乙醇。室溫保存，五年有效。2. 氯仿：室溫保存，五年有效。3. 無(wú)水乙醇：20℃保存，五年有效。4. 70%乙醇溶液：將無(wú)水乙醇和H2O按7:3混合。室溫保存，五年有效。5. TE 緩沖液（250ml）： 1 M TrisHCl，（10mM）； EDTA，（1mM）；加H2O至250ml。室溫保存，五年有效?！静僮鞑襟E】1. 在液氮中將葉片研磨粉碎，取14克樣品于合適的離心管中（初始樣品為1克，用13ml管；初始樣品1克，用50ml管）。2. 每1克樣品加入5ml CTAB提取緩沖液和2550ug RNase A（可選），顛倒混勻，6070℃水浴孵育4050min，期間混勻23次。3. 從水浴中取出樣品，冷卻至室溫?？蛇x：2025℃，3000g離心3min，轉(zhuǎn)移上清液到新管中。4. 每1克樣品加入5ml氯仿。顛倒混勻23min。5. 2025℃，10300g離心810min，轉(zhuǎn)移上清液到新管中。6. 加入等體積氯仿，重復(fù)步驟4和5?？蛇x：步驟4和5可重復(fù)多次，直到獲得澄清的上清液。7. 加入等體積的無(wú)水乙醇，輕緩顛倒混勻，直到沉淀出現(xiàn)。8. 沉淀DNA。方法1：鉤出DNA。（1） 用接種環(huán)鉤出DNA（可選：1000g離心1min，富集DNA）。（2） 將DNA（可將多個(gè)樣品的DNA合并成一管）加入70%乙醇溶液中。初始樣品為1ml， 70%；初始樣品1ml，加入裝有1012ml 70%乙醇的50ml離心管。（3） 2025℃，13000rpm（）或5100g（50ml管）離心57min，棄上清?？蛇x：用上述相同體積的70%乙醇重復(fù)洗滌DNA沉淀1次。可選：接步驟（3），以相同速度離心12min，用吸頭吸盡乙醇。方法2：離心沉淀DNA。（1）2025℃，5100g離心57min，棄上清。（2）加入56ml（13ml管）或1012ml（50ml管）70%乙醇溶液洗滌DNA沉淀，2025℃，5100g離心57min，棄上清?？蛇x：重復(fù)步驟（2）1次?？蛇x：接步驟（2），以相同速度離心12min，用吸頭吸盡乙醇。9. 干燥DNA。真空干燥≤10min，空氣干燥≤1h（30min左右），DNA過(guò)度干燥會(huì)導(dǎo)致難以溶解。10. 每1ml樣品加入100250ul TE緩沖液溶解DNA。也可適當(dāng)增加TE緩沖液用量，或?qū)NA溶液置于70℃孵育14h，促進(jìn)DNA溶解。相同樣品可合并。可4℃過(guò)夜溶解。11. DNA溶解完全后。測(cè)定DNA濃度后，根據(jù)需要，將DNA溶液分裝（每管分裝1個(gè)酶切體系所需DNA量，10ug/管），保存于4℃、20℃或80℃冰箱。DNA樣品應(yīng)有唯一性編號(hào)，并與原始樣品相對(duì)應(yīng)。12. %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度，ND1000分光光度計(jì)測(cè)量DNA濃度。OD230/OD260 ～OD260/OD280 =～OD260/OD280 OD260/OD280 【注意事項(xiàng)】1. 研磨前，研缽、離心管、藥勺等物品均需用液氮預(yù)冷徹底，研磨過(guò)程應(yīng)保證樣品不融化，研磨應(yīng)足夠細(xì)。2. 提取過(guò)程中，應(yīng)采用顛倒混勻方式，而不能渦旋混勻，所有過(guò)程保證離心管蓋蓋好，防止液體漏出。3. CTAB緩沖液裂解溫度一般為65℃，孵育結(jié)束后，應(yīng)徹底冷卻至室溫，該步驟可持續(xù)12h。4. 加入氯仿后，應(yīng)徹底混勻23min。5. 鉤出DNA時(shí)，動(dòng)作要輕緩，洗滌后要除盡乙醇。6. TE緩沖液適用于基因組DNA、質(zhì)粒DNA長(zhǎng)期保存，ddH2O適用于短期保存。DNA溶解后，輕緩晃動(dòng)離心管，若溶液中有氣泡，表明DNA濃度過(guò)高，需再加入適量TE緩沖液。7. 測(cè)定DNA溶液濃度前，應(yīng)用吸頭混勻溶液。8. ND1000分光光度計(jì)測(cè)量DNA濃度，重復(fù)兩次。若樣品DNA濃度為2100ng/ul，兩次重復(fù)差值≤177。2ng/ul；若樣品DNA濃度100ng/ul，兩次重復(fù)差值≤2%。【參考電泳圖片】完整度好時(shí)電泳帶型：?jiǎn)我粺o(wú)拖尾，點(diǎn)樣孔無(wú)殘留雜質(zhì)如下圖：提取效果不好如下圖：
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