【正文】 21年產(chǎn)100公斤高效植物生長調(diào)節(jié)劑油菜甾醇內(nèi)酯項目江西省科技計劃項目可行性研究報告計劃類別：科技攻關(guān)計劃項目名稱：農(nóng)業(yè)高技術(shù)研究與產(chǎn)業(yè)化開發(fā)項目類別：農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)計劃重大、重點項目課題名稱：年產(chǎn)100公斤高效植物生長調(diào)節(jié)劑油菜甾醇內(nèi)酯申請單位： 上海威敵生化（南昌）有限公司 （蓋章）項目（課題）負責(zé)人：張小兵起止年限： 20052007通訊地址、郵編： 江西省進賢縣工業(yè)開發(fā)區(qū)威化路(331700)聯(lián)系電話、傳真：07915690509，8326534 (Email: ryb3399@)報告編制單位： 上海威敵生化（南昌）有限公司江西省科技廳制二○○二年六月一、總論（一）項目的主要內(nèi)容及技術(shù)原理簡述本項目的主要內(nèi)容涉及到一類高效植物生長調(diào)節(jié)劑的合成技術(shù)開發(fā)及改進。本項目的技術(shù)原理是綜合利用現(xiàn)代有機化學(xué)合成技術(shù)對已有的生產(chǎn)技術(shù)進行改進，提高產(chǎn)品得率，減少污染，降低生產(chǎn)成本。植物生長調(diào)節(jié)劑（plant growth regulator），早期叫做植物激素（plant hormone或photohormone）,正式命名為植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（plant growth substance）,具備以下兩個特點：（1）它們不是能夠提供能量的營養(yǎng)物質(zhì)；（2）它們在很低濃度下即可促進或抑制或改變植物的發(fā)育進程。在生長物質(zhì)中，有五大類因普遍存在于植物中而被公認為植物激素，包括生長素（auxin）、赤霉素（gibberellin）、乙烯(ethylene)、脫落酸(abscisic acid)和細胞分裂素（cytokinin）（Scheme 1）。除內(nèi)生的生長物質(zhì)以外，一些人工合成的化合物具備上述條件也可廣義地稱作植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。隨著科學(xué)的不斷發(fā)展，新的植物生長調(diào)節(jié)物繼續(xù)被科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，如油菜素內(nèi)酯(brassinolide)、多胺(polyamine)、膨壓素(turgorin)、茉莉酸(jasmonicacid) 、寡糖素(oligosacharin) 、水楊酸(salicyclic acid) 、系統(tǒng)素(systemin) 和玉米赤霉烯酮(zealenone) 等等，原有的種類數(shù)量也在增加，生長素有四種，赤霉素有一百零八種之多，細胞分裂素也有二十多種。由于成本等原因，目前運用較多的只有吲哚乙酸系列、細胞分裂素、乙烯、赤霉素和油菜素內(nèi)酯等等。市場上許多標(biāo)注為“植物生長調(diào)節(jié)劑”的產(chǎn)品大多是以這些有效成分復(fù)配或混配的產(chǎn)品，一部分是植物生長抑制物質(zhì)如三碘苯甲酸、抑芽丹、多效唑、烯效唑、矮壯素、助壯素、丁酰肼（商品名“比久）、調(diào)節(jié)酸和抗逆倒酯等等。雖然目前人們已經(jīng)合成了許多具有類似作用的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，但是合成物質(zhì)的環(huán)境相容性無論如何是比不上天然產(chǎn)物的，即使是天然產(chǎn)物如果大劑量使用在自然環(huán)境中的殘留也會污染環(huán)境，正緣于此使用劑量很低（107—109）的油菜素內(nèi)酯格外引人注意，油菜素內(nèi)酯也因此被譽為第六代植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。 有機化學(xué)（organic chemistry）是研究有機化合物的來源、制備、結(jié)構(gòu)、性能、應(yīng)用以及有關(guān)理論和方法學(xué)的科學(xué)，是化學(xué)學(xué)科的一個分支，它的研究對象是有機化合物。有機合成化學(xué)在高選擇性的研究中取得很大的進展，出色地開創(chuàng)了一個又一個新的反應(yīng)，合成了一批又一批具有高生理活性，結(jié)構(gòu)新奇復(fù)雜的分子。金屬有機化學(xué)和元素有機化學(xué)，為有機合成化學(xué)提供了高選擇性的反應(yīng)試劑和催化劑，以及各種特殊材料及其加工方法。有機化學(xué)以它特有的分離、結(jié)構(gòu)測定、合成等手段，已經(jīng)成為人類認識自然改造自然具有非凡能動性和創(chuàng)造力的武器，近年來，計算機技術(shù)的引入，使有機化學(xué)在結(jié)構(gòu)測定，分子設(shè)計和合成設(shè)計上如虎添翼，發(fā)展的更為迅速。在我國，有機化學(xué)研究已取得一批重要成果，得到國際同行的重視在經(jīng)濟和國防建設(shè)中起了重要的作用。如：甾體化學(xué)研究及甾體藥物工業(yè)的建立；蓮心堿，蕪花酯等多種有效成分的鑒定；結(jié)晶牛胰島素的全合成，丙氨酸酵母轉(zhuǎn)移核糖核酸的人工合成；天花粉蛋白的研究及其在計劃生育中的應(yīng)用；青蒿素的結(jié)構(gòu)測定、全合成及其抗瘧應(yīng)用；美登素及三尖杉酯堿（抗癌成分）的全合成研究；氟有機材料的研究制備；有機氟化學(xué)的研究和脫鹵亞磺化反應(yīng)的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用；砷葉立德用于合成有機化學(xué)的研究，有機磷化學(xué)，有機磷萃取劑結(jié)構(gòu)與性能的研究；自由基化學(xué)及微環(huán)境效應(yīng)等工作都是其中比較突出的例子。（二）項目的目的和意義本項目的目的是運用現(xiàn)代有機合成技術(shù)合成一系列油菜甾醇內(nèi)酯，并運用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，促進增產(chǎn)增收，具有良好的社會和經(jīng)濟效益。油菜甾醇內(nèi)酯，又稱蕓薹素內(nèi)酯。這是一類以甾醇為骨架的植物內(nèi)源甾體類生理活性物質(zhì)。20世紀(jì)70年代初，美國農(nóng)業(yè)部Beltsuille中心的Mitchell等在嘗試從植物花粉中篩選和分離具有高生理活性物質(zhì)時，試驗了60多種花粉，其中以油菜花粉促進大豆苗生長作用最為突出，但這種活性物質(zhì)在花粉中的濃度僅百萬分之一左右。該中心的Mandava等于1979年從40公斤蜂蜜中收集到4毫克純的高活性物質(zhì)，經(jīng)波譜分析和單晶X衍射確定其結(jié)構(gòu)為（Scheme 1）： (22R,23R,24S)2α,3α,22,23tetrahydroxy24methylBhomo7oxa5αcholestan 6one，其化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于甾醇內(nèi)酯，故命名為油菜甾醇內(nèi)酯（brassinolide，簡稱BR）。油菜素內(nèi)酯對植物的生長發(fā)育具有多種生理功能：促進生長、增加植物的抗逆性、延緩衰老和促進細胞的再分化等等，但最突出的生理作用就是促進植物的生長。油菜素內(nèi)酯可以明顯促進綠豆和大豆上胚軸及油菜幼苗下胚軸的伸長，提高水稻、小麥、大豆和棉花等的產(chǎn)量。在園藝作物方面，24表油菜素內(nèi)酯可以提高黃瓜、葡萄、西瓜和番茄的結(jié)果率，促進芹菜、菠菜和平菇的生長。盡管油菜素內(nèi)酯與生長素促進生長的作用有協(xié)同作用，但油菜素內(nèi)酯促進生長的信號傳導(dǎo)途徑與生長素是不同的。在生長素缺乏的條件下油菜素內(nèi)酯單獨也可以促進大豆上胚軸的生長。油菜素內(nèi)酯促進伸長的啟動較生長素緩慢，但在后期的生長促進中比生長素有效。另外，油菜素內(nèi)酯在生長素缺乏的條件下不能誘導(dǎo)生長素誘導(dǎo)基因SAUR、JCW和GH的轉(zhuǎn)錄。大豆中的SAUR對外源的生長素反應(yīng)非常迅速，2,4D處理下胚軸之后，25分鐘內(nèi)就可以觀察到轉(zhuǎn)錄的增加，但油菜素內(nèi)酯誘導(dǎo)不敏感突變體dgt的伸長，卻不誘導(dǎo)SAUR的表達，說明油菜素內(nèi)酯發(fā)揮作用不依賴于生長素而進行。Sesse證明抗生長素的化學(xué)物質(zhì)并不影響油菜素內(nèi)酯誘導(dǎo)的伸長。以上說明油菜素內(nèi)酯誘導(dǎo)伸長的機制與生長素是獨立的。Rumi還發(fā)現(xiàn)在油菜素內(nèi)酯促進伸長的過程中其作用對象是內(nèi)部組織，它可以改變內(nèi)部組織細胞壁的物理特性，這是油菜素內(nèi)酯所特有的作用，生長素誘導(dǎo)伸長的靶位組織為表皮，可能正是這種差別造成了油菜素內(nèi)酯促進生長的遲效性和后效性。油菜素內(nèi)酯促進生長的機制也不同于赤霉素，雖然都可以使節(jié)間伸長，但油菜素內(nèi)酯處理的節(jié)間較粗，而且油菜素內(nèi)酯的有效濃度要低得多。赤霉素只是引起細胞變大，而油菜素內(nèi)酯有雙重效應(yīng)（伸長和分裂），引起伸長、彎曲和開裂。用赤霉素抑制劑ancymidol可以抑制赤霉素引起的綠豆上胚軸的伸長，但對油菜素內(nèi)酯的促進生長效應(yīng)無抑制作用。在植物體內(nèi), 油菜素內(nèi)酯的活性水平在油菜素內(nèi)酯生物合成代謝及去活化等層次上受到精細調(diào)控，油菜素內(nèi)酯的生物合成呈代謝網(wǎng)格狀(metabolic grid), 其生物合成酶受到終產(chǎn)物和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一些中間組分的反饋抑制。從油菜素內(nèi)酯信號的產(chǎn)生, 包括油菜素內(nèi)酯的合成活性與水平的調(diào)節(jié)及運輸, 到與膜受體結(jié)合引起信號的感知和傳遞, 并最終引起油菜素內(nèi)酯誘導(dǎo)基因的表達和特定的生理反應(yīng), 是一個連續(xù)且相互影響的過程, 并且每一個環(huán)節(jié)都受到多種內(nèi)外因子在多個層次上的調(diào)節(jié)。油菜素內(nèi)酯作為有重要生理功能的信號分子, 其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的第一步就是被其受體接受。油菜素內(nèi)酯受體的研究進展得益于對油菜素內(nèi)酯非敏感型突變體的研究。目前, 關(guān)于油菜素內(nèi)酯分子與BRI1的結(jié)合方式還不完全清楚, 由于BRI1中含有的LRR結(jié)構(gòu)域通常與一些蛋白或多肽結(jié)合, 而不是與甾醇這樣的小分子直接結(jié)合, 而在擬南芥基因組中已鑒定到2個以上甾醇結(jié)合蛋白(steroidbinding protein, SBP), 人們推測油菜素內(nèi)酯很可能先和一種SBP形成復(fù)合體, 再與BRI1結(jié)合. 關(guān)于突變體brs1 的研究則使人們對BR信號感知的認識進一步深入, BRS1基因編碼一種可分泌的絲氨酸羧肽酶(serine carboxypeptidase), 并在BRI1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的早期發(fā)揮重要作用, 但BRS1的作用似乎不是直接加工BRI1受體, 而很可能是加工SBP以使其產(chǎn)生有活性的油菜素內(nèi)酯結(jié)合蛋白, 油菜素內(nèi)酯分子與這種活性形式的油菜素內(nèi)酯結(jié)合蛋白形成復(fù)合體后, 再與BRI1的胞外結(jié)構(gòu)域連接, 進而完成油菜素內(nèi)酯信號的感知。油菜甾醇內(nèi)酯的生理活性極高，極微量就能促進植物生長。油菜甾醇內(nèi)酯對菜豆幼苗有促進細胞分裂和伸長的雙重作用，可促進整株生長，包括株高、株重和莢重等，在豆苗第二節(jié)間伸長的生物活性測定實驗中，用油菜甾醇內(nèi)酯處理過的豆苗在第二節(jié)間的生長速度是對照株的200倍。日本的藤條文雄發(fā)現(xiàn)油菜甾醇內(nèi)酯對水稻、黃瓜、菜豆、蔥、土豆、蘿卜、番茄、白菜和甘藍等作物都有明顯的促進生長的效果，它還可以使葡萄無核，對柑橘等果樹的生長也有一定促進作用。在田間實驗中它可以使萵苣、蠶豆、蘿卜和土豆等增產(chǎn)。油菜甾醇內(nèi)酯對樺、榆等樹苗不僅促進莖生長，還能使葉和側(cè)芽數(shù)增加。另外它還可以增強農(nóng)作物抗寒、抗病、抗鹽和抗雜草能力，增加農(nóng)作物產(chǎn)量，在低溫下降低水稻細胞內(nèi)離子的外滲，表明其對細胞膜有保護作用，能提高作物耐冷性。20多年的研究表明，油菜甾醇內(nèi)酯還存在于其它植物中，如未成熟的白菜種子、綠茶葉和栗樹蟲癭等等，同時在這些植物中還分離到其類似物，一般說來油菜甾體在花粉和未成熟的種子中含量最高。自油菜甾醇內(nèi)酯發(fā)現(xiàn)以來已有非常多的類似物從植物中分離和鑒定，而且還有相當(dāng)多的類似物被有機化學(xué)家們合成出來，它們都有相似（或更高或較低）的生理活性，這一類具有甾體骨架的物質(zhì)統(tǒng)稱為油菜甾體（brassinosteroids）。到目前為止，人們從植物中至少已分離到40余種天然油菜甾醇內(nèi)酯類化合物，對這些結(jié)構(gòu)及其活性的研究表明活性與四個因素有相關(guān)性：（１）2α,3α及22R,23R兩對羥基；（2）B環(huán)的6－酮或7－內(nèi)酯；（3）24號位為S構(gòu)型；（4）A/B環(huán)為反式稠環(huán)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有利用價值而且容易人工合成的主要有28高油菜甾醇內(nèi)酯（活性與油菜甾醇內(nèi)酯幾乎相當(dāng)）和24表油菜甾醇內(nèi)酯（活性相當(dāng)于天然油菜甾醇內(nèi)酯的十分之一，但由于合成相對簡單它仍然是目前使用最為廣泛的品種之一）（Scheme 2）。同時對人工合成類似物研究后還發(fā)現(xiàn)延長邊鏈可能增強活性，例如25甲基油菜甾醇內(nèi)酯（Scheme 2）具有比油菜甾醇內(nèi)酯更高的活性。目前在本研究領(lǐng)域中還有許多天然的油菜甾醇內(nèi)酯類或非油菜甾醇內(nèi)酯類但有相同（相近）效果的化合物被分離、鑒定和合成，人工合成的同類化合物也有許多被應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。（三）相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域國內(nèi)外發(fā)展現(xiàn)狀、趨勢目前人們得到油菜甾醇內(nèi)酯或其類似物有兩種方法：從天然產(chǎn)物中提取或人工合成。1．提取法（1）從蜂蠟中提取油菜甾醇內(nèi)酯的方法由于蜜蜂經(jīng)常在花粉中采集蜂蜜，所以在蜂蠟中有微量油菜甾醇內(nèi)酯，詳細資料可以參見專利CN85102899（2）以油料加工廢料為主要原料提取天然油菜甾醇內(nèi)酯浙江皇嘉生化有限公司利用西南師范大學(xué)黃志桂和趙明婕教授發(fā)明的提取天然油菜甾醇內(nèi)酯的高效萃取法新工藝,并利用油料加工廢料,以天然油菜甾醇內(nèi)酯為主要原料,再輔以其它有效成分,于1996年建立了天然油菜甾醇內(nèi)酯合劑工業(yè)化生產(chǎn)基地。人工合成的油菜甾醇內(nèi)酯是用有機化合物作材料，經(jīng)過7－20步復(fù)雜的有機化學(xué)反應(yīng)制成如表油菜甾醇內(nèi)酯或表高油菜甾醇內(nèi)酯，市面上都稱油菜甾醇內(nèi)酯，但純天然與人工合成物是不同的。（3）蕓苔素內(nèi)酯481成都新朝陽生物化學(xué)有限公司宣稱“我國科學(xué)家利用特殊方式提煉天然蕓苔素成功，并由成都新朝陽生物化學(xué)有限公司首家實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，一舉達到國際領(lǐng)先水平”，但未說明提取方式。由于產(chǎn)品中主要成分是三十烷醇，天然少量油菜素內(nèi)酯的含量很低，而三十烷醇同樣是較好的植物生長促進劑，所以關(guān)于產(chǎn)品中天然油菜素內(nèi)酯到底有多大作用不得而知。2．化學(xué)合成法由于油菜甾醇內(nèi)酯類化合物在天然植物中含量甚微（106以下），目前甚至在較長的時間內(nèi)還很難有較好的生物發(fā)酵法出現(xiàn)，化學(xué)合成無疑成為研究的關(guān)鍵和熱點。自油菜甾醇內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)確定以后，已有美國、日本、中國、意大利、白俄羅斯、捷克、德國、印度、法國、加拿大和西班牙等國的科學(xué)家相繼進行油菜甾醇內(nèi)酯及其類似物合成和活性的研究。(1982)(1982)。，同時國內(nèi)外還有幾十個研究小組致力于油菜甾醇內(nèi)酯類似物的合成研究工作。在國內(nèi)，中科院上海有機化學(xué)