【正文】 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)前 言 這本實(shí)驗(yàn)教材是為高等醫(yī)學(xué)院校細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)編寫的，適用于五年制本科、七年制臨床專業(yè)和研究生班。 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)目的，主要是通過(guò)基本技能訓(xùn)練以及觀察分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使學(xué)生了解并掌握有關(guān)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理和操作方法，進(jìn)而培養(yǎng)學(xué)生動(dòng)手實(shí)踐、觀察分析和解決問(wèn)題的能力。為達(dá)到此目的，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容自成體系，著眼于加強(qiáng)學(xué)生的基末技能訓(xùn)練，以及觀察分析問(wèn)題和科學(xué)思維能力的培養(yǎng)。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)采用生活細(xì)胞材料，由學(xué)生自己動(dòng)手取材和實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生能對(duì)細(xì)胞獲得生動(dòng)的認(rèn)識(shí)。選編了一些生物醫(yī)學(xué)常用的細(xì)胞生物學(xué)基本實(shí)驗(yàn)，如細(xì)胞的顯微測(cè)量、細(xì)胞活力測(cè)定、細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞組分的分級(jí)分離、細(xì)胞組分的化學(xué)反應(yīng)、細(xì)胞生理活動(dòng)、細(xì)胞染色體技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞融合、免疫熒光技術(shù)、電鏡技術(shù)等，為后續(xù)的課程及醫(yī)學(xué)研究打下一定基礎(chǔ)。 全書內(nèi)容共23個(gè)實(shí)驗(yàn)，五年制本科、七年制醫(yī)學(xué)專業(yè)和研究生班教學(xué)根據(jù)具體情況選擇基本實(shí)驗(yàn)，由學(xué)生自己動(dòng)手操作，少數(shù)應(yīng)用大型精密儀器的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行參觀示教，另附實(shí)驗(yàn)報(bào)告一冊(cè)。 本教材由王蕓慶主編、謝榮林副主編，參加編寫的有陳興、謝榮林、寧剛、劉冬杰、黃東陽(yáng)、紀(jì)曉輝、時(shí)偉紅、朱亞勤、黃集前、王明武、畢衛(wèi)真、張婕、三維琴和王世藩。荊永顯、李虹、王序繪制插圖，畢衛(wèi)真負(fù)責(zé)印刷出版事宜。 教材初稿曾于1989年《全國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課培訓(xùn)班》試用，參加該班的教師提出許多寶貴的經(jīng)驗(yàn)及修改意見，謹(jǐn)此致謝?，F(xiàn)在第四版在1993年第三版基礎(chǔ)上對(duì)部分實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了補(bǔ)充和修改，并增加了“酸性磷酸酶的顯示”實(shí)驗(yàn)。由于經(jīng)驗(yàn)不足，水平有限，本教材一定還有很多缺點(diǎn)和錯(cuò)誤，敬請(qǐng)使用者批評(píng)指正。 目 錄前 言 實(shí)驗(yàn)室規(guī)則……………………………………………………………… (1) 常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物了解和解剖器械的使用………………………………… (2) 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)繪圖方法與要求………………………………………（4）實(shí)驗(yàn) 一 動(dòng)物細(xì)胞的基本形態(tài)觀察和顯微測(cè)量…………………………………（5）實(shí)驗(yàn) 二 線粒體的活體染色及電鏡照片觀察……………………………………（8）實(shí)驗(yàn) 三 液泡系的活體染色及電鏡照片觀察……………………………………（10）實(shí)驗(yàn) 四 細(xì)胞中微絲的染色及微絲與細(xì)胞形態(tài)的實(shí)驗(yàn)觀察…………………… (11)實(shí)驗(yàn) 五 細(xì)胞器的光鏡切片和電鏡照片觀察……………………………………（13）實(shí)驗(yàn) 六 細(xì)胞生理活動(dòng)的觀察……………………………………………………（16）實(shí)驗(yàn) 七 細(xì)胞組分的化學(xué)反應(yīng)……………………………………………………（20）實(shí)驗(yàn) 八 細(xì)胞核與線粒體的分級(jí)分離……………………………………………（23）實(shí)驗(yàn) 九 細(xì)胞分裂的形態(tài)觀察……………………………………………………（26）實(shí)驗(yàn) 十 正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞常規(guī)核型的標(biāo)本制備…………………………… (31)實(shí)驗(yàn)十一 細(xì)胞融合…………………………………………………………………（36）實(shí)驗(yàn)十二 應(yīng)用細(xì)胞融合技術(shù)制備染色體提前凝集標(biāo)本…………………………（38）實(shí)驗(yàn)十三 培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察和計(jì)數(shù)……………………………………………（40）實(shí)驗(yàn)十四 細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)…………………………………………………（43）實(shí)驗(yàn)十五 酸性磷酸酶的顯示………………………………………………………（46）實(shí)驗(yàn)十六 腫瘤細(xì)胞的軟瓊脂集落培養(yǎng)和測(cè)定……………………………………（48）實(shí)驗(yàn)十七 電鏡生物標(biāo)本的制備及鏡下觀察………………………………………（50）實(shí)驗(yàn)十八 整裝培養(yǎng)細(xì)胞生物膜系統(tǒng)的光鏡和透射電鏡標(biāo)本制備與觀察………（54）實(shí)驗(yàn)十九 免疫熒光抗體法檢查細(xì)胞表面抗原……………………………………（56）實(shí)驗(yàn)二十 姊妹染色單體互換標(biāo)本制備與分析……………………………………（58）實(shí)驗(yàn)二十一 銀染核仁形成區(qū)的光鏡和電鏡標(biāo)本制備及觀察…………………… (60)實(shí)驗(yàn)二十二 染色體掃描電鏡標(biāo)本制備及觀察……………………………………（63）實(shí)驗(yàn)二十三 細(xì)胞顯微攝影…………………………………………………………（65） 附錄一 離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)與離心力的換算表………………………………（67） 附錄二 溶液的配制……………………………………………………（68） 主要參考資料……………………………………………………………（77）實(shí)驗(yàn)室規(guī)則 一、遵守實(shí)驗(yàn)紀(jì)律，按時(shí)到達(dá)實(shí)驗(yàn)室，不得遲到或早退。實(shí)驗(yàn)中途因故需外出時(shí)應(yīng)向任 課教師請(qǐng)假。 二、進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室之前要換好白大衣及拖鞋。 三、保持實(shí)驗(yàn)室安靜，不許在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)大聲喧嘩及隨意走動(dòng)。 四、必須嚴(yán)肅認(rèn)真地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)期間不得進(jìn)行任何與實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的活動(dòng)。 五、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)各組儀器及器材由各組自已使用，不得互相調(diào)換。要愛護(hù)儀器、標(biāo)本和設(shè) 備。如遇儀器損壞或不靈，應(yīng)及時(shí)報(bào)告任課教師，以便修理或更換，不要自行亂修。 損壞器材或設(shè)備者應(yīng)按有關(guān)規(guī)定進(jìn)行賠償。 六、注意節(jié)約實(shí)驗(yàn)材料、藥品和水、電等。 七、保持實(shí)驗(yàn)室內(nèi)清潔整齊。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組必須認(rèn)真清理各自的實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，將器材 清洗后點(diǎn)清數(shù)目，然后擺放整齊。班級(jí)值日生負(fù)責(zé)清掃室內(nèi)衛(wèi)生，關(guān)好水、電開關(guān) 和門、窗等，經(jīng)教師允許后方可離開實(shí)驗(yàn)室。 八、動(dòng)物尸體、紙片及實(shí)驗(yàn)廢物應(yīng)放到指定地點(diǎn)，不得隨意亂丟。九、有不遵守上述要求者，任課老師將終止其實(shí)驗(yàn)，并取消其當(dāng)堂實(shí)驗(yàn)成績(jī)。常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的了解和解剖器械的使用 一、常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有蟾蜍、小白鼠、大白鼠、豚鼠、貓、兔和狗等。在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中，常常根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩x用不同的動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。例如，蟾蜍可以用于觀察離體心臟搏動(dòng)情況的實(shí)驗(yàn)，小白鼠常用于樣本很大的實(shí)驗(yàn)(如藥物的半數(shù)致死量的測(cè)定等)，貓常用于測(cè)定腦內(nèi)電位的實(shí)驗(yàn)，而狗是局解手術(shù)中常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。 在我們細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，除應(yīng)用培養(yǎng)細(xì)胞外，最常用的動(dòng)物是蟾蜍和小白鼠，下面對(duì)其特點(diǎn)及基本處置做一簡(jiǎn)單的介紹。 蟾蜍 蟾蜍是兩棲類動(dòng)物，由于其取材方便，常用于各種實(shí)驗(yàn)。其細(xì)胞較哺乳類動(dòng)物的細(xì)胞大得多，因此常用于觀察細(xì)胞形態(tài)的實(shí)驗(yàn)。 1．雌雄鑒別 通常雄性蟾蜍較雌性的為小，且在其前肢的l～3趾基部有被稱為婚墊的黑疣。 2．捉拿及處死方法： 常用搗髓法處死蟾蜍，即用解剖針搗毀其腦組織和脊髓。具體方法是，左手握住蟾蜍的身體和四肢，使其腹部貼著掌心，食指壓住蟾蜍頭部前端使其盡量腹屈。在頭與軀干之間可觸及一凹陷(即枕骨大孔所在處)，右手持解剖針直插入此凹陷約l～2mm，隨即將針尖轉(zhuǎn)向頭側(cè)插入顱腔搗毀腦組織。然后將解剖針抽回并轉(zhuǎn)向尾側(cè)刺入脊椎管內(nèi)搗毀其脊髓。如此直至其四肢松軟，呼吸消失為止。 小白鼠 小白鼠是哺乳動(dòng)物，是最為常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。 1．捉拿方法： 將小白鼠放在鼠籠蓋鐵網(wǎng)上，用右手持其尾巴向后拉，小鼠則會(huì)盡力向前蹬。用左手的拇指和食指抓住其頭頂部皮膚，然后用左手小指與手掌之間夾住其尾巴。 2．處死方法： 處死應(yīng)以安樂(lè)死為原則，即使之無(wú)痛苦而迅速死亡。常用的方法有頸椎脫位法，斷頭法和二氧化碳吸入法等。斷頭法需用特殊的斷頭器，二氧化碳吸入法則將小鼠放入盛有二氧化碳的容器內(nèi)即可。頸椎脫位法的具體方法是：左手拇指和食指按住小白鼠的頭部，左手捉住其尾巴迅速向后猛拉，使其頸椎脫位而立即死亡。 3．給藥方法： 小自鼠的給藥途徑有經(jīng)口給藥、腹腔內(nèi)注射、尾靜脈注射、皮下注射、皮內(nèi)注射和肌肉注射等。我們常用的是腹腔注射。具體方法是：左手捉住小鼠(如前所述)，在其腹正中線稍外側(cè)(避開膀胱和血管)用酒精消毒后，首先將注射針頭向頭部方向刺入皮下，進(jìn)針1～2mm后，再以45176。角刺穿腹部肌肉而進(jìn)入腹腔(刺穿腹肌時(shí)有一落空感)。針頭刺入腹腔后切勿左右擺動(dòng)，以免損傷腸管或肝臟?！?0克體重。 二、常用手術(shù)器械及操作方法： 1．解剖針：用于挑、刺等。常用來(lái)?yè)v髓處死蟾蜍，持法如執(zhí)筆法。 2．解剖刀(即外科手術(shù)刀)：用于各種皮膚切口和組織切除等。持法有執(zhí)弓法與執(zhí)筆法兩種。前者用于較大力量切開較長(zhǎng)距離的堅(jiān)韌的組織，如大動(dòng)物的皮膚切口等；后者則用于小力量的短距離切開，或分離皮膚和肌肉等。 3．大剪刀：用于剪毛、皮膚、皮下組織和肌肉等。持法如圖。 4．眼科剪刀：用于剪斷神經(jīng)、血管、筋膜等細(xì)軟組織。 5．眼科鑷子：用于提取神經(jīng)、血管和筋膜等細(xì)軟組織。 6．鈍頭鑷子：用于提取臟器、組織等。 7．有鉤鑷子：用于提取皮膚切口等。 常用手術(shù)器械執(zhí)手術(shù)刀的姿勢(shì)執(zhí)手術(shù)剪的姿勢(shì)執(zhí)手術(shù)鑷的姿勢(shì)執(zhí)手術(shù)刀、手術(shù)剪、手術(shù)鑷的姿勢(shì)(張之曾編)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)繪圖方法與要求一、在仔細(xì)觀察的基礎(chǔ)上，選擇典型結(jié)構(gòu)進(jìn)行描繪，要求真實(shí)、準(zhǔn)確(注意各部結(jié)構(gòu)的比例關(guān)系)。二、用鉛筆繪圖，線條要明確清晰，圖的深淺明暗一律以點(diǎn)的疏密來(lái)表示，點(diǎn)要圓而一致，不得涂暗影或進(jìn)行其它美術(shù)加工。 三、各部結(jié)構(gòu)名稱要在一側(cè)引直線注明。各引線要平行不得交叉。四、每幅圖的大小、位置在紙面上必須安排得當(dāng)并注意紙面的整潔。實(shí)驗(yàn)一 動(dòng)物細(xì)胞的基本形態(tài)觀察和顯微測(cè)量【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹? 制備不同細(xì)胞的臨時(shí)制片，觀察、了解細(xì)胞的基本形態(tài)，學(xué)會(huì)使用測(cè)微尺，通過(guò)測(cè)量對(duì)紅細(xì)胞的進(jìn)化進(jìn)行分析?！緦?shí)驗(yàn)用品】一、材料和標(biāo)本 蟾蜍一只，人血液一滴。 二、器材和儀器 配有目鏡測(cè)微尺的顯微鏡一臺(tái)、載片十張、蓋片三張、吸水紙、手術(shù)器材一套、解剖盤一個(gè)、鏡臺(tái)測(cè)微尺一個(gè)、小平皿一個(gè)、牙簽。 三、試劑 1％甲苯胺蘭、1％甲基蘭、Ringer氏液(兩棲類用)?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容】 一、細(xì)胞的基本形態(tài)觀察 (一)原理 細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)是很多細(xì)胞的共同特點(diǎn)，在分化程度較高的細(xì)胞更為明顯，這種合理性是生物漫長(zhǎng)進(jìn)化過(guò)程所形成的。例如：具有收縮機(jī)能的肌細(xì)胞伸展為細(xì)長(zhǎng)形；具有感受刺激和傳導(dǎo)沖動(dòng)機(jī)能的神經(jīng)細(xì)胞有長(zhǎng)短不一的樹枝狀突起；游離的血細(xì)胞為圓形、橢圓形或圓餅形。 不論細(xì)胞的形狀如何，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)一般分為三大部分：細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。但也有例外。例如：哺乳類紅細(xì)胞成熟時(shí)細(xì)胞核消失。 (二)觀察方法與結(jié)果 1．制備蟾蜍脊髓壓片觀察脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞。 取蟾蜍一只，破壞腦和脊髓，在口裂處剪去頭部，除去延腦，剪開椎管，可見乳白色脊髓，取下脊髓放在平皿內(nèi)，用Ringer氏液洗去血液后放在載片上，剪碎。將另一載片壓在脊髓碎塊上，用力擠壓。將上面的載片取下即可得到壓片。在壓片上滴一滴甲苯胺蘭染液，染色10分鐘，蓋上蓋片，吸去多余染液。在顯微鏡下觀察，染色較深的小細(xì)胞是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。染成蘭紫色的、大的、有多個(gè)突起的細(xì)胞是脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞，胞體呈三角形或星形，中央有一個(gè)圓形細(xì)胞核，內(nèi)有一個(gè)核仁(參照照片)。 2．蟾蜍骨骼肌細(xì)胞的剝離與觀察 剪開蟾蜍腿部皮膚，剪下一小塊肌肉，放在載片上，用鑷子和解剖針剝離肌肉塊成為肌束，繼續(xù)剝離，可得到很細(xì)的肌纖維(肌細(xì)胞)。盡可能拉直肌纖維。在顯微鏡下觀察，肌細(xì)胞為細(xì)長(zhǎng)形，可見折光不同的橫紋，每個(gè)肌細(xì)胞有多個(gè)核，分布于細(xì)胞的周邊(參照照片)。 3．蟾蜍肝臟壓片的制備與觀察剪開蟾蜍腹腔，取一小塊(約2～3mm 3)肝放在平皿內(nèi)，用Ringer氏液洗凈，用鑷子輕壓將肝中的血擠出。然后放在載片上，制片方法同脊髓壓片。染色用甲基蘭。顯微鏡下觀察可見肝細(xì)胞核染成蘭色，肝細(xì)胞緊密排列，擠成多角形(參照照片)。 4．蟾蜍血涂片的制備與觀察 取一滴蟾蜍血液，靠近一端滴在載片上．將另一載片的一端呈45176。角緊貼在血滴的前緣，均勻用力向前推，使血液在載片上形成均勻的薄層。(圖l一1)。晾干。顯微鏡觀察可見蟾蜍紅細(xì)胞為橢球形，有核。白細(xì)胞數(shù)目少，為圓形。圖1—1血涂片的制備 5．人血涂片的制備與觀察 取人血一滴，制片方法同上。顯微鏡觀察可見人紅細(xì)胞為凹圓盤形，無(wú)核。自細(xì)胞數(shù)目少，為圓形。 6．人口腔上皮細(xì)胞標(biāo)本的制備與觀察 用牙簽刮取口腔上皮細(xì)胞均勻地涂在載片上(不可反復(fù)涂沫)，滴一滴甲苯胺蘭染液，染色5分鐘，蓋上蓋片，吸去多余染液。顯微鏡下觀察可見復(fù)蓋口腔表面的上皮細(xì)胞為扁平橢圓形，中央有橢圓形核，染成蘭色。 二、測(cè)微尺的使用 (一)原理 測(cè)微尺分目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺，兩尺配合使用。目鏡測(cè)微尺是一個(gè)放在目鏡像平面上的玻璃圓片。圓片中央刻有一條直線，此線被分為若干格，每格代表的長(zhǎng)度隨不同物鏡的放大倍數(shù)而異。因此，用前必須測(cè)定。鏡臺(tái)測(cè)微尺是在一個(gè)載片中央封固的尺，長(zhǎng)1毫米(1000μm)，被分為100格，每格長(zhǎng)度是10微米。 (二)方法 1．將鏡臺(tái)測(cè)微尺放在顯微鏡的載物臺(tái)上夾好，小心轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡測(cè)微尺和移動(dòng)鏡臺(tái)測(cè)微尺使兩尺平行，記錄鏡臺(tái)測(cè)微尺若干格所對(duì)應(yīng)的目鏡測(cè)微尺的格數(shù)(圖1—2)。2．按下式求出目鏡測(cè)微尺每格代表的長(zhǎng)度 目鏡測(cè)微尺每格代表的長(zhǎng)度(μm)=X10 三、測(cè)量人口腔上