【正文】 第一部分 基礎(chǔ)實驗實驗一 顯微鏡的基本構(gòu)造、使用和保養(yǎng)一、目的要求。二、顯微鏡的基本構(gòu)造顯微鏡是由機械裝置和光學(xué)系統(tǒng)兩大部分組成。1．機械裝置鏡座(base)和鏡臂(arm)鏡座位于顯微鏡底部,呈馬蹄形，它支持全鏡。鏡臂有固定式和活動式兩種，活動式的鏡臂可改變角度。鏡臂支持鏡筒。鏡筒(body tube)是由金屬制成的圓筒，上接目鏡，下接轉(zhuǎn)換器。鏡筒有單筒和雙筒兩種，單筒又可分為直立式和后傾式兩種。而雙筒則都是傾斜式的，傾斜式鏡筒傾斜45176。雙筒中的一個目鏡有屈光度調(diào)節(jié)裝置，以備在兩眼視力不同的情況下調(diào)節(jié)使用。轉(zhuǎn)換器(nosepiece)為兩個金屬碟所合成的一個轉(zhuǎn)盤，其上裝3—4個物鏡,可使每個物鏡通過鏡筒與目鏡構(gòu)成一個放大系統(tǒng)。載物臺(stage)又稱鏡臺，為方形或圓形的盤，用以載放被檢物體，中心有一個通光孔。在載物臺上有的裝有兩個金屬壓夾稱標(biāo)本夾，用以固定標(biāo)本；有的裝有標(biāo)本推動器，將標(biāo)本固定后，能向前后左右推動。有的推動器上還有刻度，能確定標(biāo)本的位置，便于找到變換的視野。調(diào)焦裝置 是調(diào)節(jié)物鏡和標(biāo)本間距離的機件，有粗動螺旋（coarse adjustment）即粗調(diào)節(jié)器和微動螺旋（fine adjustment）即細(xì)調(diào)節(jié)器，利用它們使鏡筒或鏡臺上下移動，當(dāng)物體在物鏡和目鏡焦點上時，則得到清晰的圖像。2．光學(xué)系統(tǒng)物鏡（objective）物鏡安裝在鏡筒下端的轉(zhuǎn)換器上，因接近被觀察的物體，故又稱接物鏡。其作用是將物體作第一次放大，是決定成像質(zhì)量和分辨能力的重要部件。物鏡上通常標(biāo)有數(shù)值孔徑、放大倍數(shù)、鏡筒長度、焦距等主要參數(shù)。如：NA ；10；160/；16㎜。其中“NA ”表示數(shù)值孔徑（numerical　aperture,簡寫為NA），“10”表示放大倍數(shù)，“160/”分別表示鏡筒長度和所需蓋玻片厚度（㎜），“16㎜”表示焦距。目鏡（coular lens）裝于鏡筒上端，由兩塊透鏡組成。目鏡把物鏡造成的像再次放大，不增加分辨力，上面一般標(biāo)有15等放大倍數(shù)，可根據(jù)需要選用。一般可按與物鏡放大倍數(shù)的乘積為物鏡數(shù)值孔徑的500—700倍，最大也不能超過1000倍的選擇。目鏡的放大倍數(shù)過大，反而影響觀察效果。聚光器（condenser）光源射出的光線通過聚光器匯聚成光錐照射標(biāo)本，增強明度和造成適宜的光錐角度，提高物鏡的分辨力。聚光器由聚光鏡和虹彩光圈（iris diaphragm）組成，聚光鏡由透鏡組成。虹彩光圈由簿金屬片組成，中心形成圓孔，推動把手可隨意調(diào)整透進(jìn)光的強弱。調(diào)節(jié)聚光鏡的高度和虹彩光圈的大小，可得到適當(dāng)?shù)墓庹蘸颓逦膱D像。光源（light source）較新式的顯微鏡其光源通常是安裝在顯微鏡的鏡座內(nèi)，通過按扭開關(guān)來控制；老式的顯微鏡大多是采用附著在鏡臂上的反光鏡，反光鏡是一個兩面鏡子，一面是平面，另一面是凹面。在使用低倍和高倍鏡觀察時，用平面反光鏡；使用油鏡或光線弱時可用凹面反光鏡。濾光片（filter）可見光是各種顏色的光組成的，不同顏色的光線波長不同。如只需某一波長的光線時，就要用濾光片。選用適當(dāng)?shù)臑V光片，可以提高分辨力，增加影像的反差和清晰度。濾光片有紫、青、藍(lán)、綠、黃、橙、紅等各種顏色的，分別透過不同波長的可見光，可根據(jù)標(biāo)本本身的顏色，在聚光器下加相應(yīng)的濾光片。三、器材顯微鏡、擦鏡紙、香柏油、二甲苯、染色玻片標(biāo)本四、顯微鏡的使用 (1)安放顯微鏡　打開鏡箱，右手緊握鏡臂，左手平托鏡座，輕放桌上，距離桌子邊緣幾厘米處，使目鏡對著觀察者。（2）檢查　檢查各部件是否完好，鏡身、鏡頭必須清潔。（3）對光　配置內(nèi)置式電光源的顯微鏡可直接打開電源開關(guān)，并調(diào)節(jié)光量，使視野內(nèi)的亮度達(dá)到明暗適宜，同時打開光圈。舊式顯微鏡應(yīng)首先將虹彩光圈的孔徑調(diào)至最大，將聚光器升至最高點，再將低倍鏡對準(zhǔn)鏡臺孔，鏡頭離載物臺約1㎝。這時，把反光鏡轉(zhuǎn)向光源，直到視野中的光線既明亮又均勻時為止。在鏡檢全過程中，根據(jù)所需光線的強弱，還可通過擴大或縮小光圈、升降聚光器加以調(diào)節(jié)。（4）調(diào)焦　光線對好后，將玻片標(biāo)本放在鏡臺上，有蓋玻片的一面朝上，被檢物體對準(zhǔn)鏡臺孔正中，用標(biāo)本移動器上的壓片夾卡緊，然后調(diào)焦。轉(zhuǎn)動粗調(diào)焦螺旋調(diào)節(jié)鏡臺與物鏡間的距離，從側(cè)面注視，以二者間距離5㎜為度。然后自目鏡觀察，慢慢轉(zhuǎn)動粗調(diào)焦螺旋，同時移動標(biāo)本移動器，直到基本看清標(biāo)本物像。（5）低倍鏡觀察　用粗調(diào)焦螺旋調(diào)焦后，再輕輕轉(zhuǎn)動細(xì)調(diào)焦螺旋，以便得到清晰的物像。如果觀察的目標(biāo)不在視野中央，可調(diào)節(jié)標(biāo)本移動器，使之恰好位于視野中央。若光線不適，可撥動虹彩光圈的操縱桿，調(diào)節(jié)光線至適宜。（6）高倍鏡觀察　在低倍鏡下將觀察的標(biāo)本部分移至視野中央，再轉(zhuǎn)動鏡頭轉(zhuǎn)換器，將高倍物鏡轉(zhuǎn)至工作位置。適當(dāng)調(diào)節(jié)亮度后，只需微微轉(zhuǎn)動細(xì)調(diào)焦螺旋，就可看到更清晰的物像。切記此時不能使用粗調(diào)焦螺旋，由于顯微鏡下觀察的被檢物有一定厚度，故在觀察過程中必須隨時轉(zhuǎn)動細(xì)調(diào)焦螺旋，以了解被檢物不同光學(xué)平面的情況。在高倍鏡下，將玻片中的被檢物按從上到下、從左到右的順序移動、觀察一遍，再由低倍鏡轉(zhuǎn)高倍鏡反復(fù)觀察幾次，以熟練高倍鏡使用。用高倍鏡觀察后，若有必要，可再換用油鏡觀察。（7）油鏡觀察　轉(zhuǎn)動粗調(diào)焦螺旋，使物鏡與鏡臺保持一定距離。滴1滴香柏油于玻片標(biāo)本待觀察的區(qū)域上，將油鏡頭轉(zhuǎn)至工作位置，眼睛從側(cè)面注視，轉(zhuǎn)動粗調(diào)焦螺旋，直至油鏡頭浸沒于香柏油內(nèi)，幾乎與載玻片相接觸，但不能相碰。然后從目鏡中觀察，用粗調(diào)焦螺旋極其緩慢地向上調(diào)節(jié)至出現(xiàn)物像為止，注意勿將粗調(diào)焦螺旋轉(zhuǎn)動方向搞反了，以免油鏡頭與載玻片相碰而損壞了鏡頭及玻片。再用細(xì)調(diào)焦螺旋調(diào)至物像清晰，此時還應(yīng)適當(dāng)增加光的亮度。如果鏡頭已提出香柏油而尚未見到物像時，應(yīng)按上述過程重復(fù)操作。使用完畢，將鏡頭從香柏油中脫離，取下玻片，用擦鏡紙擦去鏡頭和玻片上的香柏油，再用擦鏡紙蘸少許二甲苯擦拭鏡頭上的油跡，然后用干凈擦鏡紙擦去鏡頭上殘留的二甲苯。二甲苯用量不宜過多，擦試時間應(yīng)短。切忌用手或其他紙擦試鏡頭，以免損壞透鏡。（8）復(fù)原　顯微鏡使用完畢，關(guān)閉電源，將物鏡鏡頭轉(zhuǎn)開，取下玻片。擦凈載物臺和物鏡，將各部分還原，注意物鏡頭不可正對鏡臺孔，裝鏡入箱。五、顯微鏡的保養(yǎng)顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)是顯微鏡的主要部分，尤其是物鏡和目鏡。一架顯微鏡的機械裝置雖好，但光學(xué)系統(tǒng)不好，這架顯微鏡是不會起好作用的。因此，對顯微鏡要妥善保管。1．避免直接在陽光下曝曬，因為透鏡與透鏡之間，透鏡與金屬之間都是用樹脂或亞麻油仁粘合起來的。金屬與透鏡膨脹系數(shù)不同，受高熱因膨脹不均，透鏡可能脫落或破裂，樹脂受高熱溶化，透鏡也會脫落。2．避免和揮發(fā)性藥品或腐蝕性酸類一起存放，碘片、酒精、醋酸、鹽酸和硫酸等對顯微鏡金屬質(zhì)機械裝置和光學(xué)系統(tǒng)都是有害的。3．透鏡要用擦鏡紙擦拭，若僅用擦鏡紙擦不凈，可用擦鏡紙蘸二甲苯拭擦，但用量不宜過多，拭擦?xí)r間也不宜過長，以免粘合透鏡的樹脂被溶化，而使透鏡膠落。4．不能隨意拆卸顯微鏡，尤其是物鏡、目鏡、鏡筒不能隨意拆卸，因拆卸后空氣中的灰塵落入里面引起生霉。機械裝置經(jīng)常加潤滑油，以減少磨擦而受損。5．避免用手指沾抹鏡面，否則會影響觀察，沾有有機物的鏡片，時間長了會生霉，因此，每使用一次，所有的目鏡和物鏡都得用擦鏡紙擦凈。6．顯微鏡放在干燥處，鏡箱內(nèi)要放硅膠吸收潮氣。目鏡、物鏡放在盒內(nèi)并存于干燥器中，以免受潮生霉。六、幾種特殊光學(xué)顯微鏡介紹相差顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡在構(gòu)造上的不同之外是在聚光鏡下面裝有一個環(huán)狀光闌（加綠色濾光片），并且其物鏡是裝有相板的相差物鏡。此外，它還具有一個調(diào)整光線的“合軸望遠(yuǎn)鏡”（又稱“輔助遠(yuǎn)焦鏡”）。環(huán)狀光闌的作用是形成一個空心的光線錐，造成透過標(biāo)本的光線分離成直射光和衍射光2組光線。這2組光線分別從相板上的環(huán)區(qū)和環(huán)外區(qū)通過，導(dǎo)致它們之間微弱的相位差人為地擴大增強，進(jìn)而在上面透鏡的收斂作用下，這2組光線復(fù)在一條光路上發(fā)生干涉效應(yīng)，使得相位差轉(zhuǎn)變成振幅差（即明暗差），反差增強。因而通常在顯微鏡上難以觀察到的細(xì)胞細(xì)微結(jié)構(gòu)，就可以利用相差顯微鏡看清楚，同時增強被觀察物體的立體感，即景深加大，以利于觀察物體的全貌。在細(xì)胞顯微操作時尤其需要相差顯微鏡。合軸望遠(yuǎn)鏡是用在相差顯微鏡上調(diào)節(jié)光軸的輔助設(shè)備，它不能用來觀察被檢標(biāo)本。相差顯微鏡主要用于觀察未染色的活細(xì)胞，亦可用于觀察固定過的材料。被檢材料厚度不超過20μm，載玻片要求厚薄均勻，厚度在1㎜左右，㎜左右。暗視野顯微鏡是按照丁達(dá)爾（Tyndall）光學(xué)效應(yīng)原理，在顯微鏡基本結(jié)構(gòu)上換裝暗視野聚光鏡，使照射被檢物體表面的光線不能直接進(jìn)入物鏡與目鏡，而利用被檢物體表面的散射光線來觀察，～，這是普通光學(xué)顯微鏡遠(yuǎn)不可及的。它的成像特點是：黑暗的視野中可見明亮的被檢物體的明細(xì)外貌及其運動，但是看不見被檢物體內(nèi)部的細(xì)微結(jié)構(gòu)?！L之間。偏振光顯微鏡是在普通光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，加上2塊能使光線偏振的尼科爾棱鏡。裝在聚光鏡下面的那一塊稱為起偏鏡，裝在目鏡與物鏡之間的一塊稱為檢偏鏡。這2塊棱鏡中的一塊固定，另一塊可以旋轉(zhuǎn)（或者2塊均可旋轉(zhuǎn)），并注有刻度。另外，偏振光顯微鏡的鏡臺亦能旋轉(zhuǎn)。偏振光顯微鏡是利用偏振光來鑒別晶體和生物體內(nèi)某些有序結(jié)構(gòu)的光學(xué)性質(zhì)，同時也可用來鑒別某些組織中的化學(xué)成分。熒光顯微鏡是利用激發(fā)的照射，使標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)被激發(fā)出各種不同著色的熒光，從而分辨標(biāo)本內(nèi)某些物質(zhì)的性質(zhì)和位置。也可以用顯微鏡外加輕便熒光光源代替熒光顯微鏡，其觀察原理相同，只是觀察效果略差。熒光顯微鏡主要用于觀察材料中熒光染料著色的色素顆粒等特殊成分。倒置顯微鏡是將光路反轉(zhuǎn)，光線由上往下照射被檢物體，再經(jīng)過反光鏡進(jìn)入目鏡。此種顯微鏡充分利用聚光鏡與載物臺之間的距離，主要用來觀察培養(yǎng)器皿中的細(xì)胞和進(jìn)行顯微操作，當(dāng)然亦可被用作顯微鏡?！　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　∑?、實驗報告、高倍鏡和油鏡下觀察到的細(xì)菌個體形態(tài)。，應(yīng)將鏡筒徐徐上升還是下降？為什么？，為什么要在載玻片上滴加香柏油？，為什么要先用低倍物鏡觀察，而不是直接用高倍物鏡或油鏡觀察？實驗二 細(xì)菌個體形態(tài)的觀察一、目的要求1．學(xué)習(xí)觀察細(xì)菌的個體形態(tài)2．學(xué)會生物圖的繪制二、基本原理細(xì)菌的個體形態(tài)是指細(xì)菌細(xì)胞的大小，形狀等特征，利用觀察個體形態(tài)對細(xì)菌進(jìn)行初步識別和鑒定。三、器材顯微鏡、細(xì)菌三型涂片、雙層瓶（二甲苯、香柏油）、擦鏡紙四、操作步驟1．觀察前的準(zhǔn)備（1）置顯微鏡于平穩(wěn)的實驗臺上，鏡座距實驗臺邊沿約34㎝，鏡檢者姿勢要端正，一般用左眼觀察，右眼便于繪圖或記錄，兩眼必須同時睜開，以減少疲勞，亦可練習(xí)左右眼均能觀察。（2）調(diào)節(jié)光源、光線較強的天然光源宜用平面鏡；光線較弱的天然光源或人工光源宜用凹面鏡。2．低倍鏡觀察檢查的標(biāo)本需先用低倍鏡觀察，因為低倍鏡視野較大，易發(fā)現(xiàn)目標(biāo)和確定檢查的位置。將三型涂片玻片標(biāo)本置鏡臺上，用標(biāo)本夾夾住，移動推動器，使觀察對象處在物鏡正下方，轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器，㎝處，由目鏡觀察，此時可適當(dāng)?shù)乜s小光圈，否則視野中只見光亮一片，難見到目的物，同時用粗調(diào)節(jié)器慢慢升起鏡筒，直至物像出現(xiàn)后再用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)到物像清楚時為止，然后移動標(biāo)本，認(rèn)真觀察標(biāo)本各部位，找到合適的目的物，并將其移至視野中心，準(zhǔn)備用高倍鏡觀察。3．高倍鏡觀察將高倍鏡轉(zhuǎn)至正下方，在轉(zhuǎn)換物鏡時，需用眼睛在側(cè)面觀察，避免鏡頭與玻片相撞。如果高倍鏡觸及載玻片應(yīng)立即停止旋動，說明原來低倍鏡就沒有調(diào)準(zhǔn)焦距，目的物并沒找到，要用低倍鏡重調(diào)，如果調(diào)對了，換高倍鏡時基本可以看到目的物，若有點模糊，用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)就清晰可見。找到最適宜觀察的部位后，將此部位移至視野中心，準(zhǔn)備用油鏡觀察。（1）用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒提起約2㎝，將油鏡轉(zhuǎn)至正下方。（2）在玻片標(biāo)本的鏡檢部位滴上一滴香柏油，切勿加多。（3）從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在香柏油中，其鏡頭幾乎與標(biāo)本相接，應(yīng)特別注意不能壓在標(biāo)本上，更不可用力過猛，否則不僅壓碎玻片，也會損壞鏡頭。 　（4）從接目鏡內(nèi)觀察，進(jìn)一步調(diào)節(jié)光線，使光線明亮，再用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升，直至視野出現(xiàn)物像為止，然后用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距。如油鏡已離開油面而仍未見物像，必須再從側(cè)面觀察，將油鏡降下，重復(fù)操作至物像看清為止。切勿將粗調(diào)節(jié)器旋轉(zhuǎn)方向搞反了，以免油鏡頭與載玻片相碰而損壞了鏡頭及玻片。（5）觀察完畢，關(guān)閉電源，上旋鏡筒。將物鏡鏡頭轉(zhuǎn)開，取下玻片，用擦鏡紙拭去鏡頭上的油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用干凈擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。切忌用手或其他紙擦鏡頭，以免損壞鏡頭。用綢布擦凈顯微鏡的金屬部件。（6）將各部分還原，將接物鏡轉(zhuǎn)成八字形，再向下旋。同時把聚光鏡降下，以免接物鏡與聚光鏡發(fā)生碰撞，反光鏡垂直于鏡座。五、實驗報告？分別是？、高倍鏡和油鏡下觀察到的細(xì)菌形態(tài)圖。實驗三 放線菌個體形態(tài)的觀察一、目的要求掌握觀察放線菌形態(tài)的基本方法，并觀察放線菌的形態(tài)特征。二、基本原理放線菌在固體培養(yǎng)基上呈輻射狀生長而得名。放線菌是由不同長短的纖細(xì)的菌絲所形成的單細(xì)胞菌絲體。菌絲體分為兩部分，即潛入培養(yǎng)基中的營養(yǎng)菌絲（或稱基內(nèi)菌絲）和生長在培養(yǎng)基表面的氣生菌絲。有些氣生菌絲分化成各種孢子絲，呈螺旋形、波浪形或分枝狀等。孢子常呈圓形、橢圓形或桿形。氣生菌絲及孢子的形狀和顏色常作為分類的重要依據(jù)。三、器材顯微鏡，載玻片，蓋玻片，玻璃棒，接種鏟，小刀，鑷子，土樣，石炭酸復(fù)紅染液，呂氏堿性美藍(lán)染液，加拿大樹膠，玻璃紙，高氏1號培養(yǎng)基；培養(yǎng)皿等。四、操作步驟1．放線菌自然生長狀態(tài)的觀察（1）將滅菌后的高氏1號培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，每皿倒15ml左右，凝固后備用。（2）用經(jīng)火焰滅過菌的小鑷子將滅菌優(yōu)質(zhì)玻璃紙平鋪在平皿培養(yǎng)基上，如果瓊脂培養(yǎng)基和玻璃紙之間有氣泡，可以用滅過菌的玻璃棒將氣泡除去。（3）將一定量的無菌水倒入裝有土樣的無菌玻璃珠瓶中，制成菌懸液，再適當(dāng)稀釋。（4），接種在玻璃紙上，并用無菌玻璃棒涂勻后，置28℃培養(yǎng)，直至菌長好，備用。（5）在潔凈的載玻片上滴一小滴水，稍涂布。取出培養(yǎng)皿，打開皿蓋，用鑷子