【正文】 平臺簡介：以家蠶作為生物反應(yīng)器，利用分子生物學(xué)手段，構(gòu)建了系統(tǒng)的家蠶桿狀病毒高效表達(dá)藥用外源蛋白體系，建立了全方位的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)化平臺。我們在國際上首次克隆家蠶桿狀病毒（BmNPV）的P10基因并證明P10啟動(dòng)子也是強(qiáng)啟動(dòng)子，具備作為表達(dá)載體啟動(dòng)子的功能特征，首次利用BmNPV P10啟動(dòng)子在家蠶細(xì)胞中表達(dá)了氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶。成功構(gòu)建重組可救活線性化家蠶核多角體病毒基因工程載體，篩選效率提高1000倍，時(shí)間縮短10倍；成功構(gòu)建半胱氨酸蛋白缺失型家蠶核多角體病毒基因工程載體，表達(dá)效率提高40%。通過構(gòu)建一系列的新型重組病毒和表達(dá)載體，形成全新的家蠶生物反應(yīng)器技術(shù)平臺。此后，以家蠶生物反應(yīng)器技術(shù)平臺生產(chǎn)口服疫苗和藥物為研究特色，建立了家蠶生物反應(yīng)器生物制藥技術(shù)平臺和家蠶功能基因組研究技術(shù)平臺，主要致力于應(yīng)用基因工程技術(shù)和生化下游技術(shù)制備藥物及疫苗，探索基因工程藥物（疫苗）口服途徑及其產(chǎn)業(yè)化，同時(shí)開展家蠶功能基因組學(xué)的研究，探索家蠶生長發(fā)育中的基因調(diào)控機(jī)制。在國內(nèi)外學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表研究論文170余篇，其中被SCI收錄 40余篇，編寫專著6本；完成科研項(xiàng)目26項(xiàng)，其中國家級13項(xiàng)，省部級10項(xiàng)，在研項(xiàng)目4項(xiàng)；獲得國家發(fā)明專利14項(xiàng)，公開國家發(fā)明專利5項(xiàng)；在國際學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表研究論文37篇；申請國家發(fā)明專利17項(xiàng)，獲得國家發(fā)明專利7項(xiàng)。在家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服藥物和疫苗的研究、家蠶功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)以及家蠶RNA相關(guān)研究中都取得了新的突破。平臺具體內(nèi)容、研究成果：一、家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服蛋白質(zhì)藥物技術(shù)平臺體系的構(gòu)建通過一系列的新型基因工程載體的構(gòu)建，成功建立家蠶生物反應(yīng)器蛋白表達(dá)技術(shù)平臺。家蠶生物反應(yīng)器表達(dá)的產(chǎn)物經(jīng)證實(shí)可以直接用于口服藥物的開發(fā)，目前已經(jīng)證明家蠶表達(dá)生產(chǎn)的藥物由于有蠶血淋巴本身的大量蛋白的保護(hù)作用和一些未知的機(jī)理，直接經(jīng)口服給藥而進(jìn)入血液循環(huán)。這類藥物既可以免去藥物的分離純化過程，又可解除病人注射的痛苦和被感染的危險(xiǎn)。(1) 家蠶生物反應(yīng)器蛋白高效表達(dá)技術(shù)平臺的構(gòu)建國際上首次克隆并測序家蠶桿狀病毒（BmNPV）的P10基因（GenBank 登錄號為S76783），并證明P10啟動(dòng)子也是強(qiáng)啟動(dòng)子，具備作為表達(dá)載體啟動(dòng)子的功能特征，此后，首次利用P10啟動(dòng)子在家蠶細(xì)胞中表達(dá)了氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶；通過野生型家蠶核多角體病毒中國鎮(zhèn)江株BmNPV ZJ8基因組與修飾型苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒AcNPV BacPAK6基因組在家蠶細(xì)胞內(nèi)同源重組，構(gòu)建成重組救活可線性化修飾型家蠶核多角體病毒基因工程載體BmBacPAK6。BmBacPAK6含有Lac Z基因和兩個(gè)Bsu36 I酶切位點(diǎn)用于線性化。BmBacPAK6用作外源基因表達(dá)重組救活病毒篩出率幾近100％。BmBacPAK6用作載體表達(dá)人EPO基因，感染家蠶蟲體和家蠶蛹時(shí)，104U/ml血淋巴；在此基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建半胱氨酸蛋白酶缺失型BmNPV基因工程載體，通過一種半胱氨酸蛋白酶基因缺失型家蠶核多角體病毒BmZJCP基因組DNA和構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體pCPGFP與上述BmBacPAK6共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)同源重組獲得。此半胱氨酸蛋白酶缺失型病毒感染的家蠶細(xì)胞中，外源基因表達(dá)量比對照高約40％，宿主存活期及產(chǎn)物高表達(dá)期延長，從而提高總表達(dá)量。通過構(gòu)建一系列的新型重組病毒和新型表達(dá)載體，形成全新的家蠶生物反應(yīng)器蛋白高效表達(dá)技術(shù)平臺。(2) 口服有效的rhGMCSF蛋白藥物的制備及其生白效果至今，有很多的外源蛋白在家蠶細(xì)胞和幼蟲中得到表達(dá)，但作為生物反應(yīng)器，家蠶蛹可能更加適合表達(dá)外源目的基因。我們通過重組家蠶桿狀病毒在家蠶蛹中成功表達(dá)了人粒細(xì)胞巨細(xì)胞激落刺激因子（hGMCSF）。表達(dá)的重組蛋白rhGMCSF分子量為29kDa，脫糖基化分析表明和大腸桿菌表達(dá)rhGMCSF相比，家蠶蛹表達(dá)rhGMCSF經(jīng)過了糖基化后修飾，同時(shí)還可能經(jīng)過了其他的翻譯后修飾。106 cfu mg1，106 cfu mg1的重組蛋白。本研究表明家蠶蛹能夠作為一種方便的低成本的生物反應(yīng)器用于外源基因的表達(dá)。相關(guān)研究成果發(fā)表在J. 。我們通過家蠶蛹生物反應(yīng)器高效表達(dá)了rhGMCSF，為了進(jìn)一步研究家蠶蛹所表達(dá)的rhGMCSF藥效功能，從家蠶蛹中大規(guī)模純化重組蛋白成為一個(gè)較大的挑戰(zhàn)。我們建立了兩個(gè)大量純化重組蛋白的方法：分別采用硫酸銨分級沉淀和等電點(diǎn)沉淀法得到重組蛋白的初步純化產(chǎn)物，然后再結(jié)合凝膠過濾和離子交換色譜法得到純化的蛋白。研究表明，采用等電點(diǎn)沉淀法可能更加有效，通過這種方法，我們從1000g接種感染的蠶蛹中純化得到95％，106 cfu mg1。和其他方法相比，該方法純化蛋白的得率提高了大約40％。相關(guān)研究成果發(fā)表在Appl. Biochem. 。家蠶生物反應(yīng)器表達(dá)的rhGMCSF為29kDa糖蛋白（BmrhGMCSF）。生物活性檢測表明，BmrhGMCSF具有刺激人骨髓細(xì)胞形成集落的能力，集落形成效果和BmrhGMCSF成劑量依賴關(guān)系，和γ射線的照射的濃度呈負(fù)相關(guān)。動(dòng)物試驗(yàn)表明，口服BmrhGMCSF15分鐘后，可以在老鼠的血液中檢測到20kDa125I標(biāo)記的BmrhGMCSF蛋白片段。免疫組化試驗(yàn)顯示可以在老鼠腸的組織細(xì)胞中檢測到BmrhGMCSF。這些結(jié)果表明BmrhGMCSF可能通過動(dòng)物腸微絨毛被吸收到動(dòng)物血液中。動(dòng)物藥理學(xué)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)：（1）BmrhGMCSF能提高白細(xì)胞減少癥小鼠脾臟的CFUS形成能力和骨髓細(xì)胞中DNA合成能力；（2）BmrhGMCSF能顯著誘導(dǎo)恒河猴和狗骨髓粒細(xì)胞和核細(xì)胞的生長，口服BmrhGMCSF9天后，動(dòng)物的白細(xì)胞水平顯著提高，且呈劑量依賴關(guān)系。109cells/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于陰性對照組的狗。同時(shí)骨髓涂片試驗(yàn)表明，口服BmrhGMCSF動(dòng)物的白細(xì)胞中肌胚細(xì)胞和前顆粒性細(xì)胞所占百分比遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于陰性對照組動(dòng)物。以上結(jié)果表明家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)的29kDa BmrhGMCSF作為具有生物活性的細(xì)胞因子能夠通過口服產(chǎn)生效果，這為蛋白口服藥物的研制開辟了一條新的途徑。研制hGMCSF膠囊（瑞福康），經(jīng)國家新藥評審中心評審?fù)膺M(jìn)入臨床試驗(yàn)（臨床批件號：2003L02511），“蠶表達(dá)基因工程生白細(xì)胞藥物的方法”已獲得國家發(fā)明專利（專利號：）,相關(guān)研究成果發(fā)表在Eur. J. Pharm. 。為了研究家蠶生物反應(yīng)器表達(dá)的BmrhGMCSF在人體內(nèi)的口服吸收利用度，我們以每100mg蠶蛹粉中含12181。g的BmrhGMCSF制成膠囊，根據(jù)雙處理、雙周期、兩序列的隨機(jī)交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，選擇21例志愿者，口服BmrhGMCSF8181。g/ /kg，給藥后按0、、、ELISA法測定血液中hGMCSF濃度，結(jié)果表明19人口服BmrhGMCSF后，有15人血液中檢測到與正常血漿有顯著差異的血藥濃度，用梯形面積法計(jì)算藥時(shí)曲線下面積AUC，根據(jù)試驗(yàn)品的AUC與參比品的AUC比值計(jì)算相對生物利用度F值，%，%，％。受試者的血漿經(jīng)質(zhì)譜分析找到了來自hGMCSF的相關(guān)片段的序列，序列最大分子量達(dá)到7336Da，最小達(dá)到2039 Da，說明BmrhGMCSF經(jīng)過口服能被人體吸收。5個(gè)劑量組27名受試者單次口服150～900μg的rhGMCSF膠囊的一般檢查、血生化、血液學(xué)、尿液和心電圖檢查結(jié)果用藥前后均無具臨床意義的改變，無藥物不良反應(yīng)發(fā)生。18例惡性腫瘤患者在化療結(jié)束24小時(shí)后開始口服BmrhGMCSF膠囊相對安慰劑組能明顯減慢或阻止白細(xì)胞下降。30例接受放、化療患者口服BmrhGMCSF膠囊，5天內(nèi)使白細(xì)胞恢復(fù)到4109/L上，總有效率達(dá)90%，說明經(jīng)吸收的BmrhGMCSF在人體內(nèi)具有活性、具有升高白細(xì)胞的功能。相關(guān)研究成果擬發(fā)表在PLoS One。(3) 糖尿病基因工程口服疫苗的制備及其對I型糖尿病的治療研究由于家蠶生物反應(yīng)器表達(dá)蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，其表達(dá)產(chǎn)物生物活性可以和天然蛋白相媲美，我們開展了口服家蠶表達(dá)霍亂毒素B亞基（CTB）與胰島素融合蛋白對治療自身免疫性糖尿病的研究。I型糖尿病由胰島素分泌缺陷產(chǎn)生，它是一種針對胰島β細(xì)胞的自身免疫性疫病。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明通過口服一種自身抗原，如胰島素或GAD，即誘導(dǎo)了免疫耐受，產(chǎn)生了保護(hù)作用，進(jìn)而抑制糖尿病的發(fā)生?？诜膊√禺愋宰陨砜乖苷T導(dǎo)口服免疫耐受，并能有效延緩或抑制自身免疫性疾病癥狀的發(fā)生。在體內(nèi)成功誘導(dǎo)免疫耐受需要長期口服大量的蛋白抗原， CTB可作為誘導(dǎo)口服耐受的強(qiáng)大粘膜運(yùn)載系統(tǒng)，自身抗原通過與CTB蛋白偶聯(lián)可極大地較少口服自身抗原的劑量。這些都暗示CTB偶聯(lián)自身抗原不僅使口服耐受防治I型糖尿病等自身免疫性疫病更具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，而且還有潛在的治療前景。因此，在本研究中我們構(gòu)建了CTB與人胰島素融合基因（CTBINS），并在家蠶中得到高效表達(dá)，融合蛋白（20kDa）。經(jīng)檢測，該融合蛋白在家蠶中以五聚體形式存在，并且保持GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的受體結(jié)合特性以及CTB和胰島素的抗原性。非肥胖性糖尿?。∟OD）小鼠經(jīng)口服含微克級的CTB與胰島素融合蛋白的蠶血淋巴，病理組織切片實(shí)驗(yàn)表明胰島發(fā)炎程度顯著減輕。適時(shí)監(jiān)測血糖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明糖尿病的病理癥狀得到明顯延緩，過繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)亦表明口服該融合蛋白產(chǎn)生了潛在的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞從而抑制糖尿病的發(fā)生。這些結(jié)果表明家蠶生物反應(yīng)器是一個(gè)合適的生產(chǎn)口服疫苗系統(tǒng)，并通過該系統(tǒng)誘導(dǎo)針對T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病的免疫耐受，該研究是利用我國自身蠶業(yè)資源優(yōu)勢研制抗I型糖尿病口服疫苗，為I型糖尿病的治療開辟了新的途徑。相關(guān)研究成果發(fā)表在J. . . 。為了提高融合基因CTBINS在家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)水平，我們同時(shí)開展了部分多角體同源序列對外源基因在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的影響分析。本研究在融合基因CTBINS的5’端融合了部分來自多角體基因的5’非編碼區(qū)（ATAAAT）和編碼區(qū)（ATGCCGAAT）共15bp的核酸序列，因此與原CTBINS融合蛋白相比，經(jīng)過修飾的融合蛋白（mCTBINS）在其N末端增加了兩個(gè)氨基酸ProAsn。我們將新的融合蛋白mCTBINS在家蠶細(xì)胞和幼蟲中分別表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由于融合了部分多角體同源序列（PPHS），新的蛋白的表達(dá)量與原CTBINS蛋白相比提高了近4倍。進(jìn)一步分析得知，新蛋白N端增加的兩個(gè)氨基酸并未顯著影響其與神經(jīng)節(jié)苷脂（GM1）的結(jié)合能力。因此，本實(shí)驗(yàn)中所使用的15bp多角體同源序列可被用作為一個(gè)結(jié)構(gòu)元件，在多角體啟動(dòng)子下游促進(jìn)外源基因的高效表達(dá)。相關(guān)研究成果發(fā)表在Biotech. Appl. 。我們同時(shí)關(guān)注口服家蠶表達(dá)CTB與胰島素B鏈融合蛋白對治療糖尿病的效果。胰島素B鏈包含了胰島素的主要抗原決定族，僅僅口服胰島素B鏈在動(dòng)物模型中同樣能抑制糖尿病的發(fā)生，其效果與口服胰島素完整蛋白相近。經(jīng)檢測，我們構(gòu)建的CTB與人胰島素B鏈融合蛋白在家蠶中以五聚體形式存在，并且保持GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的受體結(jié)合特性以及CTB的抗原性。非肥胖性糖尿病小鼠經(jīng)口服含微克級的CTB與胰島素B鏈融合蛋白的蠶血淋巴，病理組織切片實(shí)驗(yàn)表明小鼠胰島發(fā)炎程度顯著減輕。同時(shí)適時(shí)監(jiān)測血糖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明口服中劑量的融合蛋白能延緩糖尿病的病理癥狀的發(fā)生。本研究表明口服家蠶表達(dá)的CTB與人胰島素B鏈融合蛋白可以作為一種口服蛋白疫苗，并對NOD模型鼠的胰島炎癥具有很好的抑制作用。相關(guān)研究成果發(fā)表在Vaccine上。(4) 家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)其他口服藥物和疫苗的研究我們同時(shí)還開展了其他許多重要藥用蛋白和疫苗的表達(dá)和口服研究工作。（i）家蠶表達(dá)SARS基因制備抗SARS病毒口服疫苗的研究我們獲得了SARS病毒基因組中與致病性相關(guān)的若干個(gè)基因，經(jīng)測序鑒定正確后克隆至重組轉(zhuǎn)移載體pBacPAK8中，與線性化的桿狀病毒共轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)重組病毒篩，獲得高效表達(dá)重組桿狀病毒。在將表達(dá)的幾種SARS基因疫苗注入實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)后，成功地在實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)檢測到了非典（抗SARS病毒）抗體，而非接種組均無抗體反應(yīng)。相關(guān)研究成果發(fā)表在Acta 。（ii）家蠶表達(dá)人乳鐵蛋白生產(chǎn)口服治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物研究我們獲得了在蠶體中能高效表達(dá)人乳鐵蛋白（hLf）基因的重組家蠶桿狀病毒，在家蠶中表達(dá)量高達(dá)192 μg/ml蠶血淋巴。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎模型，受實(shí)驗(yàn)動(dòng)物推薦劑量為80μg/次/kg體重。采取灌喂法，連續(xù)給藥10天后，測定各項(xiàng)指標(biāo)?？瞻讓φ战M每日灌喂等量蒸餾水。結(jié)果表明利用重組hLf治療潰瘍性結(jié)腸炎，反映臨床表現(xiàn)的DAI和組織學(xué)得到改善，髓過氧化物酶（MPO）明顯降低，有效的緩解硫酸葡聚糖鈉（DSS）誘導(dǎo)的潰瘍性急性結(jié)腸炎，為進(jìn)一步進(jìn)入臨床，生產(chǎn)口服治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物打下理論基礎(chǔ)。 Biochim. Biophys. 。（iii）家蠶表達(dá)人破骨細(xì)胞形成抑制因子生產(chǎn)口服治療高血鈣、骨質(zhì)疏松癥藥物的研究我們獲得了在家蠶中能高效表達(dá)破骨細(xì)胞形成抑制因子OPG及變體OPG372的重組桿狀病毒病毒，并發(fā)現(xiàn)rhOPG在家蠶幼蟲的表達(dá)產(chǎn)物還有二聚體的形式。將含rhOPG372的家蠶血淋巴注射到小鼠腹腔，結(jié)果表明，家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出的重組人OPG372蛋白具有良好的降血鈣生物活性，+，并呈劑量依賴關(guān)系，6 mg/kg rhOPG372的降鈣效果幾乎與鮭魚降鈣素（sCT）相當(dāng)。對小鼠每天腹腔注射一次含重組蛋白的蠶血淋巴。一個(gè)月后在股骨遠(yuǎn)端骨松質(zhì)觀察到骨小梁縱切面面積明顯增加，說明重組蛋白具有較好的生物活性。通過灌胃的方式，對小鼠進(jìn)行了降血鈣和骨保護(hù)的口服研究。結(jié)果表明，通過口服方式，一定劑量的重組蛋白也能有效的降低小鼠的血清鈣離子濃度。雖然劑量要求比注射方式要重些，但從時(shí)間來看，效果比后者持續(xù)的更久些。我們將雌性小鼠的卵巢切割，模擬婦女絕經(jīng)后雌激素分泌下降導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松，將含重組蛋白OPG的蠶血淋巴對小鼠進(jìn)行灌胃，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組蛋白能有效的阻止因雌激素缺失導(dǎo)致的骨流失。以上結(jié)果表明，家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的OPG具有潛在預(yù)防和治療高血鈣、骨質(zhì)疏松等骨相關(guān)疾病的功能。其臨床應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)還有待于進(jìn)一步的研究。相關(guān)研究成果發(fā)表在Acta Biochim. . 。（iv）家蠶表達(dá)雞傳染性法氏囊病毒VP2基因生產(chǎn)抗雞傳染性法氏囊病口服疫苗通過