【正文】 + 常用液相色譜柱使用與保養(yǎng) SOP + 主要內(nèi)容 液相色譜柱基本理論知識(shí) 常用液相 色譜柱使用方法與維護(hù)保養(yǎng) 液相 色譜柱常見問(wèn)題分析與解決方案 + 液相色譜柱的結(jié)構(gòu)及其主要功能 液相色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲（封頭）與柱填料等組成。 柱管： 多用不銹鋼制成，若果使用時(shí)柱壓不高于 70 kg/cm2時(shí)，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。用于柱填料的裝填。 壓帽： 即色譜柱兩端套合于柱管端外壁的塑性圓柱帽，中部有小孔，多為聚四氟乙烯制成，用于固定篩板。 密封環(huán)： 位于接頭螺旋環(huán)內(nèi)壁的彈性環(huán)，多為聚四氟乙烯制成，用于色譜柱兩端壓帽與柱外壁的密封。 + 液相色譜柱的分類與應(yīng)用范圍 分類方法很多，可按鍵合相類型、用途（分析型與制備型）、基質(zhì)種類等進(jìn)行分類。 （ 4大類） 目前，分析型液相色譜柱多為硅膠基質(zhì)柱，細(xì)分為： 高純硅膠柱： 以高純度硅烷化硅膠（ Silica）為填料，應(yīng)用范圍較廣，但只能在 ，小于 60度的條件下使用。又由于強(qiáng)極性硅羥基（ SiOH)的次級(jí)保留效應(yīng)較強(qiáng)，所以應(yīng)用受到局限，已被鍵合相柱所取代。 反相硅膠柱： 是以硅烷化硅膠為基質(zhì)，表面鍵合弱極性官能團(tuán)的固定相。目前多用 C18（ ODS）、 C8（ MOS）、 C4（ B）、C6H5（ phenyl，苯基）等。用于分離大多數(shù)有機(jī)化合物，應(yīng)用范圍最廣。 正相硅膠柱： 是以硅烷化硅膠為基質(zhì)，表面鍵合極性官能 團(tuán)的固定相。目前較多的為： NH2— （氨基）、 CN— （氰基）、DIOL（二羥基，也常做 HILIC單獨(dú)分類列出，多用于分離有機(jī)酸、蛋白質(zhì)等）。多用于分離光學(xué)異構(gòu)體和反相柱子不能分離的極性比較大的物質(zhì) 。 離子交換柱： 是以硅烷化硅膠為基質(zhì)，以磺化交聯(lián)鍵合強(qiáng)陽(yáng) /陰離子基團(tuán)（磺酸鹽 /季銨堿）的固定相，又分為強(qiáng)酸性、強(qiáng)堿性、弱酸性、弱堿性等不同規(guī)格。用于分離解離性較強(qiáng)的有機(jī)鹽類化合物。（ 注意： 不要同離子色譜混淆，離子色譜主要是分離無(wú)機(jī)鹽類化合物或某些帶點(diǎn)離子。） 聚合物基質(zhì)柱是指采用聚苯乙烯 — 二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸脂、多孔性微球蛋白等聚合物凝膠作為主要填料的一類色譜柱。其相對(duì)于硅膠柱具有更強(qiáng)的疏水性及更寬泛的 pH范圍（ ～ ），但柱效較低，目前主要應(yīng)用于凝膠滲透色譜（ GPC）、凝膠過(guò)濾色譜（ GFC）及分子排阻色譜（ MEC）。主要用于分離蛋白質(zhì)類等大分子化合物。 這類色譜柱僅限于特殊用途，主要有石墨化碳、氧化鋁（ Al2O3）、氧化鋯（ ZrO2）等填料。不需要進(jìn)行表面改性，其自身表面即可對(duì)各類化合物有強(qiáng)保留?？稍谌我?pH（氧化鋁除外，不能大于 ）及高溫度（可達(dá) 100℃ ）下使用。其中， 石墨化碳填料柱能分離多種化合物，主要用于分離幾何 異構(gòu)體；氧化鋁柱剛性強(qiáng)，柱床穩(wěn)定，可分離多種化合物且多用于制備色譜；氧化鋯柱較氧化鋁柱有更強(qiáng)的 pH適用范圍及能耐受更高的溫度，但其應(yīng)用尚待進(jìn)一步研究。 應(yīng)同色譜儀器檔案一樣重視色譜柱檔案，主要內(nèi)容包括：品牌、型號(hào)、系列號(hào)、購(gòu)進(jìn)日期、購(gòu)進(jìn)發(fā)票、使用記錄（使用日期、使用人、使用目的、使用情況）、維護(hù)保養(yǎng)記錄（老化時(shí)間、老化人、故障現(xiàn)象、故障原因、處理方法、處理結(jié)果及附圖）等，并以檔案盒形式保存，最好做到專柱專用。 柱填料類型 主要應(yīng)用范圍 特點(diǎn) C18（ ODS） 可分離多種化合物，最適合用于極性樣品或做離子抑制的樣品的分析 普適性好；保留性強(qiáng)，用途廣 ；可用于正相。 C8（辛基） 與 C18相似 與 C18相似，但保留值稍小 C3， C4 多用于肽類與蛋白質(zhì) 保留值更小 C1 [三甲基單氯硅烷(TMS)] 普通反相溶劑分析疏水性強(qiáng)的化合物；使用高水含量溶劑分析高極性化合物 ；分離多功能團(tuán)化合物 保留值最??；最不穩(wěn)定；可用于反相與正相 苯基，苯乙基 多用于分離分析同時(shí)含極性和非極性芳香化合物的混合物 保留值適中；選擇性有所不同 ，對(duì)極性芳香化合物選擇性更強(qiáng)；可用于正相。 柱填料類型 主要應(yīng)用范圍 特點(diǎn) CN（氰基） 適用于在 ODS上無(wú)保留或分離時(shí)間太長(zhǎng)的組分的分離，以及樣品中同時(shí)含有親水與疏水性化合物而在 ODS上色譜優(yōu)化困難的場(chǎng)合，也可用于氨基酸分析。 屬中等級(jí)性柱，普適性好；保留適中，可用于正相與反相。 NH2（氨基） 主要用于分析單糖類、 烴類化合物 保留性弱；極性大，不穩(wěn)定，酸性條件下易水解；亦可用于反相。 OH（二醇基，DIOL） 多用于有機(jī)酸、 肽類與蛋白質(zhì)分析 極性大于 CN，小于 NH2，常做 HILIC用?？煞聪嘤?。 高純硅膠柱 多用于制備 LC， 適用于多種化合物 普適性好；價(jià)廉；操作不太方便； pH窄（ ）；次級(jí)保留效應(yīng)強(qiáng)（硅羥基），易峰拖尾或前延，分叉等。 （ ） 單獨(dú)的聚苯乙烯類填料柱主要用于分離蛋白質(zhì)類等大分子化合物，多用于 GPC、 GFC、 MEC等；若與離子交換基團(tuán)共鍵則形成離子交換柱，用于分離酸性化合物（磺酸基團(tuán)）、堿性合物（季銨基團(tuán)）及藥物代謝產(chǎn)物等。特點(diǎn)：在 1＜ PH＜ 13的流動(dòng)相中穩(wěn)定；分離峰形較好，柱子壽命較長(zhǎng)。 如氧化鋁、石墨化碳、氧化鋯、硅藻土等，主要作制備色譜用。 柱填料類型 主要應(yīng)用范圍 特點(diǎn) Chiral （手性柱） 常用于分離手性異構(gòu)體，根據(jù)分離不同機(jī)理選擇。 不同化學(xué)性質(zhì)的異構(gòu)體需采用不同類型的手性柱 。部分亦可用于反相。 HILIC （親水作用柱） 最常用 Diol柱、丙基酰胺基鍵合硅膠柱，多用于分析極性化合物、端基異構(gòu)體、如藥物極性代謝產(chǎn)物、多肽、有機(jī)酸、糖類等。 多用于 ELSD檢測(cè)， C18無(wú)保留化合物，毒品檢查等。 可用于反相。 不同品牌色譜柱制備工藝各異，但都可歸納為如下流程（以硅膠柱為例）： 硅烷化硅膠制備（四乙氧基硅烷脫乙基與聚合） → SiOH 基暴露（ 脫乙基，置換成 H） → 海綿狀多孔硅膠構(gòu)造（物理勻質(zhì)過(guò)程） → 官能團(tuán)鍵合（各種官能團(tuán)與 SiOH 鍵合） → 端基封口（對(duì)殘余的 SiOH 用小分子的氯 甲基、氯 乙基鍵合 ） → 潤(rùn)濕混合（加乙醇等調(diào)勻，其配方各廠家均有專利保護(hù)） →裝填（機(jī)械裝填或手工裝填，層層裝填，壓緊，潤(rùn)濕） → 高壓平衡（軸向加壓或徑向加壓，各廠家均有專利保護(hù)） → 干燥（此步為關(guān)鍵工藝步驟，各廠家均有專利保護(hù)） → 削平 → 組件安裝 → 預(yù)平衡 → 柱效測(cè)試流動(dòng)相平衡 → 柱效測(cè)試 → 封口 → 包裝 色譜柱類型 分離機(jī)理 備注 常規(guī)反相柱 相似相溶 常規(guī)正相柱 相似相溶 離子交換柱 樣品離子與色譜柱離子達(dá)到置換動(dòng)態(tài)平衡 要關(guān)注 pH條件 手性柱（ Chiral column） 氫鍵作用、偶級(jí) 偶級(jí)作用、ππ作用、靜電作用、疏水作用、空間作用 一般， AGP、 HSA、BSA等以疏水作用、空間作用為主 。 親水性色譜柱 （ HILIC） 氫鍵作用、偶極作用和靜電作用等多種次級(jí)效應(yīng)及相似相溶 基于 NP原理 氨基酸分析柱 相似相溶 基于 RP原理 + 常用液相 色譜柱使用方法與維護(hù)保養(yǎng) (1)認(rèn)識(shí) 色 譜 柱 規(guī) 范化使用與保養(yǎng)的必要性： 延 長(zhǎng) 色 譜 柱使用壽命， 降低色 譜 柱使用成本，逐步提高分析人 員 色 譜 柱使用與 維護(hù) 水平，確保 試驗(yàn) 數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性、可靠性和重 現(xiàn) 性，提升個(gè)人在色 譜領(lǐng) 域的 競(jìng) 爭(zhēng)力。 (2)熟悉幾個(gè)概念： ? 液相色 譜 柱： 指用于液相色 譜 分離的柱形固定相，由柱管、 壓 帽 /卡套、 篩板（ 濾 片）、填料、接 頭 等 組 合而成，可用于液相色 譜 分析與制 備 。 ? 色 譜 柱再生： 指色 譜 柱在非正常情況下， 針對(duì) 異常 現(xiàn) 象及原因采取的一系列修復(fù) 補(bǔ) 救措施，以提高色 譜 柱柱效和延 長(zhǎng) 其使用壽命的 處 理 過(guò) 程。 ? 運(yùn) 載 溶 劑 （Shipping Solvent）：指色 譜 柱生 產(chǎn) 廠商在柱出廠 測(cè)試 合格后 飽和于色 譜 柱內(nèi)的合適溶 劑 ，以利于運(yùn) 輸 保存，多與保存溶 劑 相同。 ? 保存條件（ Storage Conditions）：指色 譜 柱生 產(chǎn) 廠商根據(jù)不同柱 類 型及其色 譜 柱填料的制 備 、鍵 合、裝填、高 壓 定型、 凈 化干燥等工 藝 條件的不同要求而特 別 制定的色 譜 柱保存前 凈 化 飽 和的 處 理程序與 儲(chǔ) 存條件，包括 凈 化程序、 凈 化溶 劑 和保存溶 劑 、保存溫度。 ? 保存溶 劑 （Storage Solvent）：用于保存色 譜 柱并指定了溶 劑組 成與 比例的溶液。 (3)對(duì)新柱正確老化處理的 必要性 認(rèn)識(shí)：新購(gòu)色譜柱出廠前均采用適 合的運(yùn)載溶劑（ Shipping Solvent）飽和，密封，由于運(yùn)輸過(guò)程周期較長(zhǎng)，柱床容易干涸，所以新柱使用前需重新飽和與老化。若老化方法不正確或時(shí)間不夠，極易導(dǎo)致色譜柱在使用較短時(shí)間后即產(chǎn)生分離度下降、峰形變差、峰拖尾等柱效降低的情況。需根據(jù)色譜柱不同類型選擇不同飽和與老化方法。 C8及 C18反相色譜柱（ C8amp。C18 Reversedphase chromatography column） （ 1）準(zhǔn)備新鮮超純水及色譜級(jí)乙腈或甲醇，沖洗色譜儀器系統(tǒng)，保證儀器系統(tǒng)管路干凈。（新柱老化前，此步?jīng)Q不可忽略） （ 2）將色譜柱反向連接，不接檢測(cè)器。用水 有機(jī)相（ 90： 10～ 95:5），以～ ～ 30min。（目的是沖洗出柱入口端無(wú)機(jī)雜物與篩板孔雜物，使篩板正常） （ 3）再將色譜柱正向連接，不接檢測(cè)器。用水 有機(jī)相（ 90： 10～ 95:5），以 ～～ 30min。（目的是沖洗出柱出口端無(wú)機(jī)雜物與篩板孔雜物，使篩板正常） （4）連 接 檢測(cè) 器，開啟柱溫達(dá) 30℃ ～ 40℃ ，用水 有機(jī)相（ 90：10～ 95:5），以～ 。（目的是充 飽 和色 譜 柱，去除柱內(nèi)空氣） （5）用水 有機(jī)相（ 10：90～ 5:95），以 ～ [或在120min內(nèi)以水 有機(jī)相（ 95:5→0:100 ）梯度 變 化，以 ～ 洗 ]→ 再用 100%有機(jī)溶 劑 ，以 ～ → 最