重組人促紅細胞生成素的純化【精品(已修改)
2025-01-30 20:04 本頁面
【正文】 重組人促紅細胞生成素的純化 2022級生命科學(xué)基地 賓雪 楊丹 什么是促紅細胞生成素？ ? 促紅細胞生成素 (Erythropoietin， EPO)是一種促進紅系造血前體細胞分化，繁殖的細胞因子。 ? EPO產(chǎn)生于人的腎及胎兒的肝臟。 EPO的研究歷史 ? 1977年 Miyake 等人首先經(jīng)過 7步純化從在障性貧血患者尿中獲得毫克量級尿 EPO（ urine EPO， uEPo） ? 尿液，血漿，胎盤浸出液 ? 80年代后期編碼人 EPO基因被克隆 ? 重組人 EPO（ rebinant human EPO, rhEPO）在哺乳動物細胞中成功表達 rhEPO的應(yīng)用 ? 臨床應(yīng)用重組人促紅細胞生成素可治療慢性腎衰竭合并貧血癥，慢性腎功能衰竭（ CRF）貧血，骨髓增生異常綜合癥貧血（ Myelodysplastic Syndrom ,MDS），AIDS病人的伴生貧血，（非髓性）腫瘤伴生貧血及腫瘤化療貧血， β地中海貧血 ,鐮刀形貧血 ,早產(chǎn)兒貧血等 .也可用于外科手術(shù)中的自體輸血、骨髓移植等。 EPO理化性質(zhì) ? 疏水性極強 ? 酸性糖蛋白 ? pI ~ ? MW 30~39kD, 其中糖鏈約占 39% ? 兩個鏈內(nèi)二硫鍵 ? rhEPO和天然 EPO結(jié)構(gòu)極為相似，僅在唾液酸連接上有細微差別(:26:2633) ? 經(jīng)等電聚焦電泳計算其 pI為 ～ 常來講 ,一種蛋白質(zhì)只有一個 pI,但 EPO的 pI并非如此 ,卻出現(xiàn)較多條帶 ,原因是 EPO的糖基化程度的微小差異而造成空間構(gòu)象和分子大小不同。 EPO純化歷史 ? Miyake的七步法：純化步驟太多 ,對設(shè)備及操作要求也較高 ,不適合工業(yè)生產(chǎn)的特點 ? Spivik利用凝集素親和層析純化 EPO：由于凝集素親和層析凝膠易被雜蛋白不可逆吸附 ,使得分離效果降低 ,成本增高 ,也不利于大規(guī)模生產(chǎn) ? 疏水層析 ,凝膠柱層析等 三步層析法 ? 1. 染料配基親和層析 → 反相疏水層析 → 離子交換層析 。 ? 2. 染料配基親和層析 → 反相疏水層析 → 分子篩層析 。 ? 3. 反相疏水層析 → 離子交換層析 → 分子篩層析 . 三步純化法 用三步法純化重組人促紅細胞生成素 李 琳 鄧繼先 盧建申 周 江 （軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所 北京 100071） 生物技術(shù)通訊 1997年第 8卷第 1期 三步純化基本流程 ? 第一步： 反相柱色譜 樣品濃縮約 % ? 透析 ? 第二步： DEAE離子交換色譜 ? 第三步： 分子篩色譜 總回收率 〉 30% 比活 *108U/g蛋白 生產(chǎn)細胞株： CHOEPO C2 （由軍科院生物工程研究所提供） 細胞培養(yǎng)基：含 5%FBS和 5*107mol/LMTX的DMEM培養(yǎng)基（ Gibco公司產(chǎn)品） 生產(chǎn)培養(yǎng)基： 無 FBS的 DMEM： F12（ 1： 1）培養(yǎng)基（ Gibco公司產(chǎn)品），另添加一些 維生素和小分子多肽 ? 培養(yǎng)方法簡介： ? 凍存細胞 擴增培養(yǎng) %胰蛋白酶消化 接種 堆積床反應(yīng)器 〉 1*10 7 無血清培養(yǎng)基灌流培養(yǎng) 第一步：反相色譜 ? C6 反相柱（ 2cm*2cm） （創(chuàng)新生物技術(shù)公司） ? 流程： 上樣 50ml/min（ 柱結(jié)合量約 5mg蛋白 /ml介質(zhì) ） 去離子水 平衡至檢測基線 10%~80%乙醇胍 線性梯度洗脫 檢測并收集含 EPO主峰 ELISA測定 結(jié)果： 60%乙醇 1mol/L鹽酸胍 洗出 EPO 透析 ? 透析液： 10倍體積的 10mmol/L (pH )2%蔗糖緩沖液 ? 透析次數(shù)： 2 ? 時間： 5~6h 分析 ? 相關(guān)歷史： 1980年 Sylvia Lee Huang 報道了使用疏水柱層析純化 uEPO，提示 EPO是一種疏水性較強的蛋白。 不足： 層析條件劇烈，活性喪失多。 ? 80年代后期，反相高壓液相純化成為趨勢，多用于離子交換柱的后續(xù)步驟。 第二步：離子交換柱 ? DEAE型離子交換柱 ? 流程：
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