【正文】 第 2章 微生物發(fā)酵制藥工藝 本章內(nèi)容 微生物發(fā)酵與制藥 制藥微生物生長特征 制藥微生物菌種的建立 培養(yǎng)基制備 滅菌工藝 微生物發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù) 發(fā)酵工藝過程的控制 抗生素生產(chǎn)工藝 氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝 維生素生產(chǎn)工藝 微生物發(fā)酵與制藥 ? ?? 發(fā)酵 ? ?? 發(fā)酵制藥 ? ?? 發(fā)酵制藥的基本過程 1 發(fā)酵概念 ? 發(fā)酵概念：通過微生物培養(yǎng)而獲得產(chǎn)物的過程。 ? 發(fā)酵種類：用產(chǎn)品說明，冠以產(chǎn)物名而成，如青霉素發(fā)酵，維生素發(fā)酵；發(fā)酵工程按需氧分為好氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵。 ? 初級代謝產(chǎn)物：在初級代謝過程中形成的產(chǎn)物，包括各種小分子前體、單體和多糖、蛋白質(zhì)、脂肪、核酸等。生長所必須的。幾乎所有生物初級代謝基本相同。氨基酸，核苷酸，有機(jī)酸。 ? 次級代謝產(chǎn)物：比較復(fù)雜的化合物，不是細(xì)胞生長必需的，對生命活動有意義（抗逆境條件）。抗生素，毒素，色素。 發(fā)酵制藥 概念 ? 利用制藥微生物的生長繁殖，通過發(fā)酵，代謝合成藥物，然后從中分離提取、精制純化，獲得藥品的過程 抗生素的發(fā)現(xiàn) ? 1928年，英國細(xì)菌學(xué)家 Fleming B發(fā)現(xiàn)抗菌物質(zhì)青霉素。在 20世紀(jì) 40年代，一共發(fā)現(xiàn)了 14種抗生素， 50年代發(fā)現(xiàn)了 20余種， 60年代開始了化學(xué)結(jié)構(gòu)改造的合成和半合成抗生素階段。目前發(fā)現(xiàn)并分離到約 9000種抗生素，半合成抗生素約 1000種，共萬種以上。但實際生產(chǎn)和應(yīng)用的只有 100余種。 發(fā)酵制藥種類 ① 微生物菌體發(fā)酵 ? 微生物菌體發(fā)酵是以獲得微生物菌體為目的，如：面包的酵母發(fā)酵、單細(xì)胞蛋白發(fā)酵（利用各種碳源）、真菌類（各種蘑菇、冬蟲夏草）、生物防治劑（蘇云金桿菌，伴孢晶體可以毒殺鱗翅目、雙翅目害蟲）。 ② 微生物酶發(fā)酵 ? 微生物酶發(fā)酵是以獲得酶為目的的發(fā)酵，如青霉素?；福糜诎牒铣汕嗝顾貢r，制備中間體 6－氨基青霉烷酸。 ③ 微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵 ? 初級代謝產(chǎn)物：氨基酸，核苷酸，維生素，有機(jī)酸。 ? 次級代謝產(chǎn)物：最主要的是抗生素。 ④ 微生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵 ? 利用微生物的一種或多種酶把一種化合物轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)相關(guān)的更有價值的產(chǎn)物的生化反應(yīng)為轉(zhuǎn)化發(fā)酵。 制藥微生物的種類 ? 生產(chǎn)藥物的天然微生物主要包括 細(xì)菌 、 放線菌 和 絲狀真菌 三大類。 ? 細(xì)菌 主要生產(chǎn)環(huán)狀或鏈狀多肽類抗生素，如芽孢桿菌(Bacillus)產(chǎn)生桿菌肽（ bacitracin），多黏芽孢桿菌（ Bacillus polymyxa）產(chǎn)生黏菌肽（ colistin）和多黏菌素（ polymyxin）。細(xì)菌還可以產(chǎn)生氨基酸和維生素，如黃色短桿菌（ Brevibacterium flarum）產(chǎn)生谷氨酸，大小菌生產(chǎn)維生素 C。 ? 放線菌 主要產(chǎn)生各類抗生素，以鏈霉菌屬最多，諾卡菌屬較少，還有小單孢菌屬。生產(chǎn)的抗生素主要有氨基糖苷類（鏈霉素、新霉素、卡那霉素等）、四環(huán)類（四環(huán)素、金霉素、土霉素等）、放線菌素類（放線菌素 D）大環(huán)內(nèi)酯類（紅霉素、螺旋霉素、柱晶白霉素）和多烯大環(huán)內(nèi)酯類（制霉菌素、抗滴蟲霉素等）。酸性、堿性和中性，但以堿性為多。 ? 真菌 的曲菌屬產(chǎn)生桔霉素，青霉素菌屬產(chǎn)生青霉素和灰黃霉素等，頭孢菌屬產(chǎn)生頭孢霉素等。脂環(huán)芳香類或簡單的氧雜環(huán)類，多為酸性化合物。 3發(fā)酵制藥的基本過程 菌種選育 發(fā)酵工段 提煉工段 成品工段 孢子制備 種子制備 發(fā)酵控制 預(yù)處理 分離提取 濃縮純化 成品工段 包裝 原料藥 實驗室、種子庫 發(fā)酵車間 提煉車間 包裝車間 微生物的生長特征 微生物發(fā)酵基本過程特征（批式）菌體生長與產(chǎn)物生成的特征，三個階段 ? 發(fā)酵前期 (fermentation prophase) ? 菌體生長期（ cell ? 發(fā)酵中期 (fermentation metaphase) ? 產(chǎn)物合成（生產(chǎn)）期 (product synthesis phase) growth phase） ? 發(fā)酵后期 (fermentation anaphase) ? 菌體自溶期 (cell autolysis phase) 發(fā)酵前期特征 ? 從接種至菌體達(dá)到一定臨界濃度的時間，包括延滯期、對數(shù)生長期和減速期。 ? 代謝特征：碳源、氮源等基質(zhì)不斷消耗，減少 ? 生長特征：菌體不斷地生長和繁殖，生物量增加。 ? 溶氧變化：不斷下降，菌體臨界值時，濃度最低。 ? pH變化：先升后降－先氨基酸作為碳源，釋放出氨，而后氨被利用。先降后升－先用糖作為碳源，釋放出丙酮酸等有機(jī)酸，后又被利用。 幾個概念 ? 1 延遲期 延滯期（ lag phase）或適應(yīng)期是指接種后，菌體的生物量沒有明顯增加的一段時間。延遲期是菌體適應(yīng)環(huán)境的過程。延遲期時間長短不一，與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)，由菌體與環(huán)境相互作用的程度決定的。因不同接種量、不同菌種和菌齡等而表現(xiàn)不同。工業(yè)上希望延遲期越短越好，常采用如種子罐與發(fā)酵罐培養(yǎng)基盡量接近，對數(shù)期的菌體作為種子、加大接種量等方法進(jìn)行放大培養(yǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)。 ? 2 對數(shù)生長期 對數(shù)生長期（ log phase）是菌體快速繁殖，生物量的增加呈現(xiàn)對數(shù)速度增長的過程。特點是生長速率達(dá)到最大值，并保持不變。細(xì)胞的化學(xué)組成與生理學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。菌體生長不受限制，細(xì)胞分裂繁殖和代謝極其旺盛?？梢哉J(rèn)為細(xì)胞組分恒定，菌體細(xì)胞的生長速率與生物量是一級動力學(xué)關(guān)系 ? 3 減速期 減速期 (decline phase)是指菌體生長速率下降的一段時間。由培養(yǎng)基中基質(zhì)濃度下降，有害物質(zhì)積累等不利因素引起。在減速期內(nèi)，生長速率與菌體濃度仍符合一級動力學(xué)關(guān)系，但受基質(zhì)濃度限制。一般生物的減速期較短。 發(fā)酵中期特征 ? 以次級代謝產(chǎn)物或目標(biāo)產(chǎn)物的生物合成為主的一段時間。 ? 菌體生長恒定就進(jìn)入產(chǎn)物合成階段 ? 呼吸強(qiáng)度：無明顯變化，不增加菌體數(shù)目 ? 產(chǎn)物量：逐漸增加，生產(chǎn)速率加快，直至最大高峰，隨后合成能力衰退。 ? 對外界變化敏感：容易影響代謝過程，從而影響整個發(fā)酵進(jìn)程。 發(fā)酵后期特征 ? 菌體衰老，細(xì)胞開始 自溶 的一段時間 ? 合成產(chǎn)物能力衰退，生產(chǎn)速率減慢。 ? 氨基氮含有增加， pH上升 ? 發(fā)酵必須結(jié)束，否則產(chǎn)物被破壞 ? 菌體自溶給過濾和提取等帶來困難。 ? 自溶作用（ autolysis） 自溶作用是細(xì)胞的自我毀滅（ cellular selfdestruction），速溶酶體將酶釋放出來將自身細(xì)胞降解。在正常情況下，溶酶體的膜是十分穩(wěn)定的，不會對細(xì)胞自身造成傷害。 如果細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，造成溶酶體破裂，那么細(xì)胞就會在溶酶體酶的作用下被降解，如某些紅細(xì)胞常會有這種情況發(fā)生。 在多細(xì)胞生物的發(fā)育過程中，自溶對于形態(tài)建成具有重要作用。 生長與產(chǎn)物的關(guān)系模型 ? 從菌體生長、能源利用和產(chǎn)物生成速度的變化及其之間的動力學(xué)關(guān)系出發(fā)， Gaden把發(fā)酵過程分為三種模型。 ? I型：菌體生長與產(chǎn)物生成偶聯(lián)型 (coupling model)。菌體的生長與產(chǎn)物生成直接關(guān)聯(lián)，生長期與生產(chǎn)期是一致的。產(chǎn)物往往是初級代謝的直接產(chǎn)物，菌體生長、糖的分解代謝、能源利用和產(chǎn)物形成幾乎平行，生長期與生產(chǎn)期是一致的，菌體生長期和產(chǎn)物形成不是分開的。細(xì)胞生長、基質(zhì)消耗、能源利用和產(chǎn)物生成動力學(xué)曲線幾乎平行，變化趨勢同步，都有最大值，出現(xiàn)的時間接近。組成型表達(dá)的基因工程菌的產(chǎn)物生成屬于此類型，蛋白質(zhì)產(chǎn)物是細(xì)胞能量代謝的結(jié)果。乳酸、醋酸等初級分解代謝產(chǎn)物的生成也屬于此類型。所以產(chǎn)物生成速率和比速率分別為： ? II型：菌體生長與產(chǎn)物生成半偶聯(lián)型（ semicoupling model）。該模型介于偶聯(lián)和非偶聯(lián)模型之間，產(chǎn)物生成與基質(zhì)消耗、能量利用之間存在間接關(guān)系。產(chǎn)物來自能量代謝所用的基質(zhì)，但是在次級代謝與初級代謝分開的。在細(xì)胞生長期內(nèi)，基本無產(chǎn)物生成，在生長的中后期生成大量的產(chǎn)物而進(jìn)入產(chǎn)物形成期。分批發(fā)酵出現(xiàn)兩個高峰，先是基質(zhì)消耗和菌體生長的高峰，然后是產(chǎn)物形成的高峰。如檸檬酸和某些氨基酸的發(fā)酵，一部分組成型表達(dá)的蛋白質(zhì)藥物也屬于此類型。產(chǎn)物生成速率和比速率分別為： ； ? III型：菌體生長與產(chǎn)物生成非偶聯(lián)型（ noncoupling model）。菌體生長期與產(chǎn)物生成期為獨立的兩個階段，先形成物質(zhì)消耗和菌體生長高峰，幾乎沒有或很少有產(chǎn)物生成，然后進(jìn)入菌體生長靜止期，產(chǎn)物大量生成，并出現(xiàn)產(chǎn)物高峰。產(chǎn)物可能來自于中間代謝途徑，而不是分解代謝過程，物質(zhì)消耗和菌體生長之后，菌體利用中間代謝途徑，初級代謝與產(chǎn)物形成是完全分開的，如抗生素、生物堿、微生物毒素的發(fā)酵。對于誘導(dǎo)型基因工程菌，往往在靜止期，加入誘導(dǎo)物，基因轉(zhuǎn)錄和產(chǎn)物表達(dá)，所以產(chǎn)物生成速率和比速率分別為： 代謝產(chǎn)物的生物合成 ? 代謝（ metabolism）是生物體內(nèi)進(jìn)行的生理生化反應(yīng)的統(tǒng)稱。代謝分為分解代謝 (catabolism)和合成代謝 (anabolism)，前者是指把大分子降解為小分子的過程，為合成代謝提供能量和原料；而后者是指把小分子合成為復(fù)雜大分子的過程，滿足細(xì)胞生長和分化的需要。 初級代謝是營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)和對細(xì)胞具有生理活性作用的物質(zhì)，為細(xì)胞提供能量、合成中間體及其生物大分子的代謝網(wǎng)絡(luò)。在初級代謝過程中形成的產(chǎn)物為初級代謝產(chǎn)物（ primary metabolite），包括各種小分子前體、單體和多糖、蛋白質(zhì)、脂肪、核酸等。幾乎所有生物的初級代謝基本相同。 次級代謝存在于某些生物中，并在一定時期表達(dá)。次級代謝對正常的生長可能不必要，但對抵抗逆境、分解毒素、生殖等具有重要意義。 次級代謝產(chǎn)物生物合成的基本特征 ? （ 1）次級代謝產(chǎn)物種類繁多，結(jié)構(gòu)特殊，含有不常見的化合物和化學(xué)鍵。如氨基糖、苯醌、香豆素、環(huán)氧化合物、生物堿、內(nèi)酯、核苷、雜環(huán)等基團(tuán)，聚乙烯不飽和鍵、大環(huán)、環(huán)肽等鍵。 ? （ 2）具有種屬特異性，與種屬分類學(xué)無關(guān)。分類學(xué)上相同的菌種能產(chǎn)生不同結(jié)構(gòu)的抗生素，如灰色鏈霉菌既可以產(chǎn)生氨基環(huán)醇類抗生素，又可以產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。分類學(xué)上不同的菌種能產(chǎn)生相同結(jié)構(gòu)的抗生素，如霉菌和鏈霉菌均可產(chǎn)生頭孢菌素 C。一種微生物的不同菌株產(chǎn)生結(jié)構(gòu)不同的多種次級代謝物，而同一菌株會產(chǎn)生一組結(jié)構(gòu)類似的化合物。 ? （ 3）生長期轉(zhuǎn)向生產(chǎn)期，形態(tài)與生理發(fā)生變化。次級代謝產(chǎn)物是在細(xì)胞生長后期開始形成，當(dāng)生長受限制時被啟動。完成菌體營養(yǎng)生長期（ trophophase）之后，出現(xiàn)次級代謝物合成期（ idiophase），其生物合成比生長對環(huán)境更敏感，要求更高。次級代謝產(chǎn)物是以初級代謝產(chǎn)物為前體，受到初級代謝的調(diào)節(jié)。可能是缺乏某種營養(yǎng)成分，菌體生長抑制，啟動了次級代謝物合成。菌體內(nèi)中間代謝物積累，抑制了初級代謝酶，使之消失或活性下降，誘導(dǎo)了新酶的出現(xiàn)，轉(zhuǎn)入生產(chǎn)期。芽孢桿菌形成芽孢，放線菌和真菌形成孢子，抗生素合成可能是細(xì)胞分化的伴隨現(xiàn)象。 ? （ 4）次級代謝產(chǎn)物是結(jié)構(gòu)相似的一組混合物，但活性差異較大。參與反應(yīng)的酶的底物特異性不強(qiáng)。產(chǎn)生菌利用一種或兩種以上的初級代謝產(chǎn)物合成一種主要的次級代謝產(chǎn)物，并繼續(xù)對該產(chǎn)物進(jìn)行修飾生成多種衍生物。一種次級代謝產(chǎn)物可由兩種或兩種以上代謝途徑合成。 ? （ 5）次級代謝產(chǎn)物的合成受多基因控制。往往以基因簇形式存在。除染色體外，還有細(xì)胞質(zhì)遺傳物質(zhì)，可能存在于質(zhì)粒、線粒體基因。遺傳物質(zhì)的變異和丟失是導(dǎo)致菌種退化和生產(chǎn)不穩(wěn)定的重要因素，所以具有代謝不穩(wěn)定性。 次級代謝產(chǎn)物的構(gòu)建單位 ? 微生物合成的次級代謝產(chǎn)物是由微生物代謝產(chǎn)生的一些中間產(chǎn)物，如由碳水化合物降解生成的五碳（ C5）、四碳（ C4）、三碳（ C3）、二碳（ C2）化合物和初級代謝產(chǎn)物合成。 把構(gòu)成次級代謝產(chǎn)物的基本結(jié)構(gòu)單位稱為生源（ biogen）。生源直接或間接來源于次級代謝過程的中間產(chǎn)物或初級代謝產(chǎn)物。構(gòu)建單位包括聚酮體、甲羥戊酸、糖類、不常見的氨基酸（如 D－氨基酸、β－氨基酸等）、環(huán)多醇和氨基環(huán)多醇等。 次級代謝產(chǎn)物的生物合成的基本過程 ? 次級代謝產(chǎn)物的合成基本過程包括構(gòu)建單位的聚合 — 再修飾 — 裝配。在此過程中，次級代謝產(chǎn)物的累積受合成途徑中某些酶活性的限制，這些關(guān)鍵酶活性大小與產(chǎn)量正相關(guān)。 （ 1）前體聚合 ? 微生物合成生源后，通過縮合反應(yīng)形成聚酮體、寡肽、聚乙烯等。 各種聚酮體的合成過程相似，只是起始單位和延長單位不同。聚酮體是 2－ 6個二碳單位的聚合反應(yīng)的結(jié)果，酮基被保留，或只是還原為羥基。聚酮體可直接形成環(huán)，如四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類。進(jìn)而被修飾，與相應(yīng)基團(tuán)如氨基糖、糖胺等結(jié)合，形成結(jié)構(gòu)和生理活性不同的化合物。乙酰 CoA羧化形成丙二酰 CoA，再與 8個丙二酰單位縮合形成